谢青云
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 供职机构：南京农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- RNA解螺旋酶A表达系统的探究及其动力学研究
- 2016年
- [目的]RNA解螺旋酶A（RNA helicase A,RHA）参与许多细胞生物学过程中,并能促进艾滋病病毒1型（HIV-1）等一些病毒的复制,本试验旨在探究温度、p H值对RHA的动力学影响。[方法]利用PCR扩增全长RHA基因,构建重组载体p ET-28a-RHA和p Cold-Ⅰ-RHA,分别转化至BL21 star（DE3）和BL21、Rosetta2菌株中,加IPTG分别在28℃和15℃中诱导表达。将全长RHA基因重组到p Fast Bac Dual载体中,然后将重组穿梭载体转化到含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,通过转座作用,将RHA基因整合到杆状病毒基因组中。提取重组杆状病毒基因组（重组杆粒DNA）,将重组杆粒DNA转染到sf9细胞中,收集细胞,纯化蛋白,可以得到完整的RHA。建立体外解螺旋反应体系,改变温度、p H值,检测RHA活性的变化。[结果]完整RHA在BL21、Rosetta2中可微量可溶表达。sf9可以表达有活性的完整RHA。反应温度降低时,解螺旋速率变小,RHA活性降低。p H值在6.5-8.0范围内,随着p H值升高,RHA活性升高;当p H值大于8.0时,RHA活性降低。[结论]完整的RHA在BL21、Rosetta2中可微量表达;有3＇-tailed解旋极性的RHA活性受温度、p H影响较大。
- 刘红蕊吴诚诚单衍可谢青云邢刚雷静施志玉孙海凤刘斐
- 关键词：RNAHELICASE大肠杆菌表达系统杆状病毒表达系统PH
- 大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制被引量：1
- 2017年
- [目的]表达、提纯DEx H/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(sm FRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末端单链RNA尾巴的13 bp双链RNA作为研究底物,基于全内反射的单分子荧光共振能量转移技术,在自制的样品通道内添加800 nmol·L-1Ded1p、2 mmol·L-1ATP/Mg2+以及研究底物进行解螺旋试验,再用自编的Matlab程序采集和分析数据,进而从单分子层面探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[结果]首次通过Ni-NTA凝胶亲和层析与Capto-DEAE凝胶阴离子交换层析两步纯化手段,得到了大量纯净的、并且具有双链RNA解螺旋酶活性的Ded1p。Ded1p的sm FRET试验在单分子层面实现了对Ded1p打开13 bp双链RNA过程的实时观察。通过分析FRET的变化过程,首次提出Ded1p主要以一步解螺旋的方式打开双链RNA结构。[结论]原核表达、纯化的Ded1p具有RNA解螺旋酶活性;该Ded1p是以局部双链打开的模式解开RNA双链。
- 赵富林徐明飞谢青云单衍可雷静施志玉孙海凤刘斐
