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刘斐

作品数：13 被引量：42H指数：3
供职机构：南京农业大学动物医学院更多>>
发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划中国博士后科学基金更多>>
相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>

合作作者

文献类型

  • 13篇中文期刊文章

领域

  • 11篇农业科学
  • 2篇医药卫生
  • 1篇生物学

主题

  • 5篇病毒
  • 3篇细胞
  • 3篇RNA
  • 2篇猪瘟
  • 2篇核酸
  • 2篇非洲猪瘟
  • 2篇腹泻
  • 2篇杆菌
  • 2篇肠杆菌
  • 2篇大肠杆菌表达
  • 1篇蛋白
  • 1篇蛋鸡
  • 1篇等温
  • 1篇动力学
  • 1篇动力学研究
  • 1篇血清生化
  • 1篇血清生化指标
  • 1篇氧化苦参
  • 1篇氧化苦参碱
  • 1篇荧光

机构

  • 13篇南京农业大学
  • 2篇江苏省农业科...
  • 2篇中国农业科学...
  • 1篇华南农业大学
  • 1篇浙江大学

作者

  • 13篇刘斐
  • 3篇雷静
  • 2篇孙海凤
  • 2篇周继勇
  • 2篇邢刚
  • 2篇施志玉
  • 2篇谢青云
  • 1篇步志高
  • 1篇虞德兵
  • 1篇白昀
  • 1篇顾金燕
  • 1篇冯志新
  • 1篇刘红蕊
  • 1篇赵东明
  • 1篇张越

传媒

  • 3篇畜牧与兽医
  • 3篇病毒学报
  • 2篇南京农业大学...
  • 1篇中国农业科学
  • 1篇畜牧兽医学报
  • 1篇生物工程学报
  • 1篇中国畜牧兽医
  • 1篇中国细胞生物...

年份

  • 1篇2025
  • 4篇2024
  • 3篇2023
  • 1篇2022
  • 1篇2018
  • 1篇2017
  • 1篇2016
  • 1篇2015
共 13 条 记 录，以下是 1-10
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排序方式：
重组酶介导等温核酸扩增结合核酸试纸条即时检测猪流行性腹泻病毒方法的建立
2024年
本文旨在建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)结合核酸试纸条的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可视化检测方法,以应用于养殖场内部实现现场快速检测。选择PEDV N基因保守序列为模板,设计特异性引物及荧光探针,对引物进行对比筛选,对反应条件、引物浓度、探针浓度进行优化,并对其特异性、敏感性和重复性进行评价。将建立的检测方法应用于临床样品,并与荧光定量PCR方法进行比较。结果表明:建立的方法在38℃恒温10 min扩增反应以及5 min侧流向层析后,即可完成检测,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪德尔塔冠状病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应,最低检测限可达101拷贝/μL。应用该方法检测20份阴性和20份阳性,共40份临床样本,检测结果与荧光定量PCR方法保持一致。本研究建立的RAA结合核酸试纸条的方法具有特异性好、灵敏度高、耗时短、仪器设备简便等优点,适用于基层现场快速检测。
易玮婕李嘉豪赵伊然单衍可刘斐
关键词：猪流行性腹泻病毒
RNA解螺旋酶A表达系统的探究及其动力学研究
2016年
[目的]RNA解螺旋酶A（RNA helicase A,RHA）参与许多细胞生物学过程中,并能促进艾滋病病毒1型（HIV-1）等一些病毒的复制,本试验旨在探究温度、p H值对RHA的动力学影响。[方法]利用PCR扩增全长RHA基因,构建重组载体p ET-28a-RHA和p Cold-Ⅰ-RHA,分别转化至BL21 star（DE3）和BL21、Rosetta2菌株中,加IPTG分别在28℃和15℃中诱导表达。将全长RHA基因重组到p Fast Bac Dual载体中,然后将重组穿梭载体转化到含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,通过转座作用,将RHA基因整合到杆状病毒基因组中。提取重组杆状病毒基因组（重组杆粒DNA）,将重组杆粒DNA转染到sf9细胞中,收集细胞,纯化蛋白,可以得到完整的RHA。建立体外解螺旋反应体系,改变温度、p H值,检测RHA活性的变化。[结果]完整RHA在BL21、Rosetta2中可微量可溶表达。sf9可以表达有活性的完整RHA。反应温度降低时,解螺旋速率变小,RHA活性降低。p H值在6.5-8.0范围内,随着p H值升高,RHA活性升高;当p H值大于8.0时,RHA活性降低。[结论]完整的RHA在BL21、Rosetta2中可微量表达;有3＇-tailed解旋极性的RHA活性受温度、p H影响较大。
刘红蕊吴诚诚单衍可谢青云邢刚雷静施志玉孙海凤刘斐
关键词：RNAHELICASE大肠杆菌表达系统杆状病毒表达系统PH
猪圆环病毒2型与猪圆环病毒相关性系统疾病的回顾及展望被引量：22
2015年
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起猪的免疫抑制,是猪圆环病毒相关性系统疾病(PCV2-systemic disease,PCV2-SD)的主要病原,给养猪业带来了巨大的经济损失。文中从PCV2的进化历程、编码蛋白、对免疫系统的影响及技术防控四方面入手,对PCV2及PCV2-SD进行了全面回顾与展望。
顾金燕邢刚雷静刘斐周继勇
关键词：PCV2进化历程编码蛋白
海兰褐壳蛋鸡小黄卵泡颗粒细胞全长转录组测序分析
2023年
【目的】获取鸡小黄卵泡颗粒细胞(granulosa cells of small yellow follicle,SYFG)全长转录组数据,为深入挖掘鸡卵泡发育内在分子调控信息提供参考。【方法】采用PacBio高通量测序平台,对海兰褐壳蛋鸡SYFG进行测序、过滤、聚类和矫正原始数据,获取全长转录本序列。通过生物信息学软件对全长转录本数据进行功能注释、转录因子注释、编码区序列(coding sequence,CDS)预测、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)预测筛选、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)检测及可变剪接(alternative splicing,AS)和选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)分析。【结果】通过测序共获得52311条海兰褐壳蛋鸡SYFG全长转录本,长度主要分布于1~3500 bp。通过与GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot和Pfam数据库比对,对转录本序列进行注释,其中GO数据库注释了26525条转录本,KEGG数据库注释了25233条转录本,COG数据库注释了31303条转录本,NR数据库注释了34284条转录本,Swiss-Prot数据库注释了30701条转录本,Pfam数据库注释了24622条转录本。此外,经鉴定或预测,还获得了559个转录因子、40944个CDS、14699个lncRNAs、7种类型的SSR、28423个AS和2747个APA事件。【结论】本研究获得了鸡SYFG全长转录组测序数据,提升了转录本的数量和长度,完善了转录本的功能注释,分析了AS和APA事件的类型,揭示了转录本的复杂性,为进一步从转录组水平解析鸡卵泡发育的分子调节机制提供数据支持。
片慧芳杜旭彬李妍张雨辰刘斐虞德兵
关键词：海兰褐壳蛋鸡卵泡发育
利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系被引量：1
2018年
该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。
刘玉兰李娅慧张宜娜刘斐胡伯里周继勇
关键词：基因敲除自噬
猫杯状病毒VP1蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立
2025年
旨在建立一种灵敏、准确、高通量检测猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)抗体的间接ELISA方法。本研究通过优化表达条件,在大肠杆菌中表达FCV的VP1蛋白,对重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化和透析复性,通过SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白;以重组VP1蛋白为包被抗原建立检测FCV抗体的间接ELISA方法,通过方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和抗体最佳稀释度,优化抗原包被条件、样品孵育时间、封闭液种类等条件,并对其性能进行验证。结果:表达的目的蛋白条带清晰、大小正确,与FCV阳性血清具有良好的反应性,建立的间接ELISA方法检测6份FCV阴性血清,猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)阳性血清,猫疱疹病毒(feline herpesvirus, FHV)阳性血清均为阴性,对FCV阳性血清的最低检出效价可达1∶10 240,组间与组内变异系数均小于10%,与商品化试剂盒相比符合率达100%。综上,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏度、重复性和符合率,与其他猫常见病毒阳性血清不发生交叉反应,可以用于临床样品的检测,为FCV感染的诊断、防控、疫苗免疫效力评价提供了技术手段。
姬晶晶王彬何昭群李嘉豪单衍可刘斐
关键词：原核表达间接ELISA
单病毒示踪SADS-CoV通过网格蛋白介导的内吞入胞
2024年
猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)是一种能够引起仔猪急性腹泻的新发冠状病毒,因其在体外广泛的物种嗜性,具有潜在的跨种传播风险。本研究首先利用单病毒示踪技术平台实现了对SADS-CoV入胞动态过程的可视化;接着,结合网格蛋白介导的内吞途径(Clathrin-mediated endocytosis,CME)抑制剂(氯丙嗪)和表皮生长因子通路底物15突变体质粒确定了SADS-CoV依赖CME的入胞路径。通过对SADS-CoV依赖CME的入胞动态事件进行可视化分析,发现SADS-CoV入胞后形成的网格蛋白包被的囊泡(Clathrin-coated vesicle,CCV)出现了去包被的现象,并进一步发现SADS-CoV依赖CME内化后可快速进入早期内体,同时CME介导SADS-CoV入胞后的CCV去包被现象是发生在早期内体中。综上,本研究基于单病毒示踪技术,解析了SADS-CoV依赖CME内化后快速进入早期内体中发生CCV去包被的动态过程,进一步加深了对SADS-CoV感染过程的理解,也为抗病毒药物的研发提供理论依据。
洪文广安达裴义杨永乐李燕单衍可黄耀伟刘斐
关键词：内吞
猪流行性腹泻病毒解旋酶Nsp13表达纯化及其RNA解旋活性鉴定
2024年
旨在可溶性表达并纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)解旋酶Nsp13,并验证表达纯化得到的PEDV Nsp13蛋白具有RNA解旋活性。将pET28a(+)-PEDV Nsp13重组质粒转化到大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中,利用终浓度0.5 mmol/L的IPTG在18℃条件下诱导16 h,收集诱导后的菌体,超声破碎并收集其上清液,通过镍亲和层析技术获得纯化后的PEDV Nsp13;设计RNA底物,并建立体外解旋反应体系,验证蛋白的RNA解旋活性,并在相同时间内探究不同温度条件下PEDV Nsp13蛋白对RNA的解旋情况,进一步验证其活性。结果表明,在大肠杆菌系统中可溶性表达了PEDV Nsp13蛋白,纯化后蛋白浓度可达0.9 mg/mL;通过体外解旋试验,验证了PEDV Nsp13蛋白具有ATP依赖的RNA解旋酶活性,并发现PEDV Nsp13蛋白的RNA解旋酶活性在一定范围内随解旋温度的升高而提高。本研究结果为进一步深入研究PEDV Nsp13的RNA解旋作用机制奠定了基础。
沈熹涓姬晶晶金慧琴李宇哲刘斐单衍可
关键词：PEDV可溶性表达
SARS-CoV-2入胞活细胞示踪平台的建立被引量：1
2023年
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)由于其高传染性已造成全球大流行。目前关于SARS-CoV-2依赖内吞途径进入细胞的研究偏向于药物抑制实验或固定样品的蛋白共定位实验,而对于其入胞时与细胞内吞结构相互作用的动力学机制研究较少。本研究首先基于慢病毒系统包装出可在生物安全二级实验室(BSL-2)进行操作的SARS-CoV-2假病毒,之后利用膜染料对假病毒的囊膜进行荧光标记,并进行鉴定。通过免疫荧光方法观察到假病毒与网格蛋白包被的内吞结构共定位,进一步在网格蛋白敲低的Caco-2细胞系上进行假病毒感染,检测到荧光素酶活性显著下降,这些结果确定了网格蛋白介导的内吞作用参与假病毒感染。最后基于单病毒示踪技术,通过共聚焦显微镜对假病毒入胞过程进行活细胞实时拍摄,选取两个具有代表性的假病毒粒子依赖网格途径入胞的典型视野,并对假病毒动力学进行分析。本研究成功建立了SARS-CoV-2假病毒入胞活细胞示踪平台,可应用于研究单个假病毒粒子入胞过程动力学机制。该平台对SARS-CoV-2入胞机制的研究具有重大意义。
李宇哲李阳阳沈熹涓刘斐单衍可
关键词：假病毒
大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制被引量：1
2017年
[目的]表达、提纯DEx H/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(sm FRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末端单链RNA尾巴的13 bp双链RNA作为研究底物,基于全内反射的单分子荧光共振能量转移技术,在自制的样品通道内添加800 nmol·L-1Ded1p、2 mmol·L-1ATP/Mg2+以及研究底物进行解螺旋试验,再用自编的Matlab程序采集和分析数据,进而从单分子层面探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[结果]首次通过Ni-NTA凝胶亲和层析与Capto-DEAE凝胶阴离子交换层析两步纯化手段,得到了大量纯净的、并且具有双链RNA解螺旋酶活性的Ded1p。Ded1p的sm FRET试验在单分子层面实现了对Ded1p打开13 bp双链RNA过程的实时观察。通过分析FRET的变化过程,首次提出Ded1p主要以一步解螺旋的方式打开双链RNA结构。[结论]原核表达、纯化的Ded1p具有RNA解螺旋酶活性;该Ded1p是以局部双链打开的模式解开RNA双链。
赵富林徐明飞谢青云单衍可雷静施志玉孙海凤刘斐
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