李春宏
- 作品数：11 被引量：49H指数：5
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究基金云南省自然科学基金“九五”国家科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖被引量：10
- 2001年
- 目的探索戊型肝炎病毒(HEV)敏感细胞及体外培养条件,为HEV体外研究提供基础。方法用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化,超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞(包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞(非洲绿猴肾细胞Vero),通过细胞病变观察、RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7～9d出现细胞病变,11～13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela、Vero细胞未见细胞病变,分别于2～4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感,本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。
- 乐耕耘吴娟马雁冰杜瑞娟庄俊英谢天宏李春宏戴长柏孙茂盛
- 关键词：戊型肝炎病毒RT-PCRKMB17二倍体细胞戊型肝炎
- 戊型肝炎病毒DNA免疫的研究被引量：5
- 2001年
- 利用PCR方法获得 116 3bp的戊型肝炎 (HepatitisEVirus,HEV)开放读码框架 (OpenReadingFrame ,ORF)ORF2之 3’大片段和 36 9bpORF3的完整片段 ,分别克隆到真核表达载体 pcDNA3中 ,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNA :pcE2和pcE3 ,分别或混合免疫Swiss小鼠三次 (0时 ,第 2周 ,第 4周 ) ,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明 ,pcE2和 pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEVIgG抗体 ,且在第三次免疫接种两周后 ,10 0 %的小鼠抗体阳转。与两种质粒单独免疫相比 ,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEVDNA疫苗的研究打下一定基础。
- 吕冬梅陈尔佳谢天宏庄俊英刘勇李春宏孙茂盛戴长柏
- 关键词：DNA免疫戊型肝炎病毒体液免疫
- 一定钙、磷水平和钙磷比对生长期恒河猴血清钙、磷及碱性磷酸酶的影响
- 目的通过测定分析生长期实验恒河猴血清Ca、P和AKP,进一步为其日粮Ca、P水平的筛选提供试验依据。方法将40只自繁健康的生长期实验恒河猴,随机分为A、B两个大组,A组为1.6%Ca水平、B组为0.98%P水平,再根据钙...
- 和占龙鲁帅尧赵远黄璋琼陈丽雄李春宏王俊斌
- 关键词：恒河猴钙磷碱性磷酸酶
- 文献传递
- 轮状病毒VP7基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性被引量：17
- 2001年
- 轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体。VP7是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原 ,是发展基因工程疫苗的首选。把包含全部 3个主要抗原性区域的轮状病毒SA11VP7基因片段以谷胱甘肽S 转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 30 %左右。经一步GlutathioneSepharose4B亲和纯化 ,重组蛋白纯度超过 90 %。Westernblot实验表明 ,重组蛋白可被抗SA11的多抗特异地识别。动物实验表明 ,重组抗原可在小鼠和家兔体内诱导VP7特异的抗体和一定水平的SA11中和抗体。
- 袁力勇刘勇李春宏孙茂盛戴长柏
- 关键词：轮状病毒VP7大肠杆菌免疫原性
- 戊型肝炎病毒ORF2片段与ORF3嵌合重组抗原的纯化与免疫学性质被引量：6
- 2001年
- 目的 考察具有多个优势抗原表位区段嵌合表达的戊型肝炎病毒（HEV）重组抗原的免疫学性质。方法 将构建的含有3个不同HEV抗原表位基因(ORF2．1: 6287 ～ 6403nt, ORF2．2: 6743 ～ 7126nt, ORF3)的表达质粒pThioHisORF(2．1＋2．2＋3 )在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，其表达产物P_(2．1＋2．2＋3 )在8 mol/L尿素下经阳离子柱SP Sepharose FF层析纯化，透析复性。以P_(2．1＋2．2＋3 )免疫家兔和小鼠, 通过ELISA检测实验动物血清及戊型肝炎患者阳性血清IgG抗体，以Western蛋白印迹检测动物免疫血清对杆状病毒系统表达的抗原片段及嵌合抗原P_(2．1＋2．2＋3 )对患者阳性血清的免疫反应性。结果 纯化的抗原纯度达90%以上；免疫动物血清中检测到特异性抗体的滴度分别为1∶25 600（家兔）和1∶12 800（小鼠）以上，抗血清能够特异识别杆状病毒系统表达的HEV抗原片段，P_(2．1＋2．2＋3 )能与患者阳性血清特异反应。结论 嵌合表达的HEV重组抗原P_(2．1＋2．2＋3 )具有良好的免疫原性和免疫反应性，为进一步研究开发HEV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础。
- 唐浩马雁冰杜瑞娟乐耕耘李春宏庄俊英刘勇孙茂盛戴长柏
- 关键词：戊型肝炎病毒纯化免疫
- 轮状病毒VP7 DNA免疫研究被引量：1
- 2001年
- 目的研究促使基因分泌或膜锚定表达的基因修饰对轮状病毒 VP7DNA疫苗所诱导抗体水平的影响。方法把携带野生型 (VP7wt)、分泌型 (VP7s)和膜锚定型 (VP7tm ) 3种 VP7基因的重组 pc DNA3质粒分别免疫小鼠 ,用大肠杆菌表达的重组 VP7抗原检测 VP7特异的抗体反应 ,统计分析。结果 3种 DNA疫苗均能诱导轮状病毒 VP7特异的 Ig G抗体反应 ,但其抗体水平之间无显著性差异。结论把轮状病毒 VP7基因导入分泌或膜锚定表达途径不能增强其
- 刘勇袁力勇庄俊英李春宏冮宏映马雁冰孙茂盛戴长柏
- 关键词：分泌基因修饰DNA疫苗
- 人血纤维蛋白溶酶原K5环的基因合成、表达、纯化与活性鉴定被引量：6
- 2001年
- 根据大肠杆菌遗传密码的偏爱性 ,人工合成人血纤维蛋白溶酶原 K5全基因 ,并在原核系统中以硫氧还蛋白融合蛋白的形式实现了高效表达 .重组蛋白通过 Ni2 +金属螯合层析得到初步纯化 ,通过肠激酶切割去除了融合标签 .应用鸡胚尿囊膜实验检测切割后的 rh K5的生物学活性 ,发现与对照组相比 ,rh K5能明显地降低血管管径、血管总面积以及血管总面积与视野面积的比值 ,表明切割后的产物具有显著抑制新生血管生成的生物学活性 .为进一步研究和开发抗血管生成药物奠定了基础 .
- 袁力勇马雁冰刘勇庄俊英李春宏冮宏映孙茂盛戴长柏
- 关键词：基因合成基因表达肿瘤治疗
- 戊型肝炎病毒ORF2 C端抗原片段的表达及其免疫学特性研究被引量：4
- 2000年
- 目的 表达戊型肝炎病毒 (hepatitisEvirus ,HEV)ORF2C端 12 8个氨基酸残基的抗原片段ORF2 3 ,并进行其免疫学特性的研究。方法 用pBV2 2 0载体进行抗原的非融合表达 ,包涵体经变性凝胶过滤层析及离子交换层析纯化后透析复性 ,以Westernblot、ELISA、动物免疫与抗原捕获RT nPCR等方法研究其免疫学特性。结果 获得了ORF2 3的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白 5 0 %左右 ,纯化后纯度达 98%以上 ,Westernblot表明表达抗原可与戊肝患者阳性血清特异性结合 ;在HEV感染恒河猴实验中用于IgG抗体的检测 ,具有较好灵敏度与特异性 ;用其免疫豚鼠 ,抗体经ELISA法测定效价为 1∶80 0 0 ;用制备的豚鼠抗血清捕获戊型肝炎病毒颗粒 ,经RT nPCR扩增出特异性片段。结论 ORF2 3抗原片段具有HEV抗体识别的抗原表位 ,能够刺激机体产生抗体 。
- 马雁冰孙茂盛李鸿钧唐浩杜瑞娟李春宏张光明谢天宏戴长柏
- 关键词：戊型肝炎病毒免疫学特性
- 戊型肝炎病毒抗原基因片段及其组合表达质粒的构建被引量：1
- 2000年
- 目的选择及组合戊肝病毒 (HEV)抗原基因片段 ,进行表达与免疫学特性研究。方法根据已公布的 HEV序列 ,选择三段优势抗原表位 ,经 RT- PCR扩增基因片段 ,产物以单独或经甘氨酸连接肽串联组合的方式克隆到载体 pThioHis C中 ,经 DNA序列分析后 ,将构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行表达 ,并以 Western印迹分析初步考察其免疫学特性。结果构建的六个重组质粒在大肠杆菌中获得了不同程度的表达 ,表达的目的蛋白具有与戊型肝炎患者阳性血清特异性结合的能力。结论 HEV抗原片段及其组合在大肠杆菌中得到了高效表达 ,并为优良诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供了基础。
- 唐浩马雁冰李春宏杜瑞娟乐耕耘庄俊英刘勇孙茂盛戴长柏
- 关键词：基因克隆大肠杆菌基因表达戊型肝炎病毒
- 重组戊型肝炎病毒抗原免疫恒河猴及其对病毒攻击的保护被引量：2
- 2002年
- 目的了解重组抗原免疫恒河猴的抗体应答情况及其对病毒攻击的保护作用。方法利用大肠杆菌表达的戊型肝炎(HEV)病毒3个不同的片段,分别为Ag1(ORF2C端431aa)、Ag2(ORF2C端128aa片段)、Ag3犤ORF3122aa与ORF26287-6404碱基编码的39aa片段以及C端128aa依次以(Gly)n短臂连接的嵌合抗原犦免疫恒河猴,用ELISA方法检测IgG抗体水平,3周后达到较高水平应答时,用HEV阳性粪便样静脉注射进行攻击,经肝脏病理切片观察、血清IgG、丙氨酸转氨酶(ALT)水平测定及粪便排毒的RT-nPCR检测来评价抗原对病毒攻击的保护作用。结果对照组3只猴中两只发现肝脏组织产生明显的病理性改变,而免疫了抗原的试验组12只猴正常;对照组均在攻毒后3～4周发生ALT异常,为正常值的10～20倍,而试验组有部分猴不同程度轻微的ALT异常,其余正常;试验组免疫抗原后IgG水平迅速上升,滴度可达1∶12800;对照组粪便中病毒RNA的检出在攻毒后7～50d左右,而试验组7～21d内以低水平存在。结论重组的抗原片段诱发机体产生针对HEV的抗体应答,能够抑制HEV感染引起的肝炎症状的产生。
- 马雁冰谢天宏张光明李春宏戴解杰戴长柏孙茂盛鲁健毕胜利
- 关键词：戊型肝炎病毒戊型肝炎疫苗抗体应答抗原免疫
