王涛
- 作品数：7 被引量：41H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白特异结合宿主细胞60kD SSA/Ro
- 2014年
- 为了初步探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核蛋白(nucleoprotein,NP)对宿主细胞免疫功能的影响。将SFTSV NP和NSs蛋白的编码基因插入真核表达载体VR1012中,通过免疫共沉淀(IP)、SDS-PAGE、质谱检测及蛋白质免疫印迹等方法寻找宿主细胞中与NP相互作用,同时又与免疫功能有关的蛋白质分子,并利用细胞免疫荧光方法检测SFTSV NP与该分子在细胞中的共定位情况。IP和质谱检测结果显示NP能与免疫功能相关的60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,细胞免疫荧光试验进一步显示NP与60kD SSA/Ro蛋白在细胞质中存在共定位。提示SFTSV可能通过其核蛋白与免疫相关分子60kD SSA/Ro蛋白发生特异性结合,从而引起机体一系列的免疫反应和临床症状。
- 郑斌王涛张硕李阿茜李川张全福梁米芳李德新
- 关键词：SSA
- 汉滩病毒S基因的分段表达及其线性和构象型抗原表位分析
- 2005年
- 构建汉滩病毒76-118 N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化.通过Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应.构建汉滩病毒76-118 N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS7细胞中进行表达.通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应.而仅有N蛋白及缺失N端1～30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应.证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1～30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合.
- 王涛张全福李川刘琴芝李建东梁米芳李德新
- 关键词：汉滩病毒核蛋白S基因基因表达
- 人源抗严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因工程抗体的初步研究被引量：9
- 2003年
- 严重急性呼吸道综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)或称传染性非典型肺炎,已严重威胁人民健康和生命安全。快速研制一种可用于紧急预防SARS病毒感染的基因工程抗体预防制剂迫在眉睫。为此,运用噬菌体表面呈现技术,从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库,并筛选获得37株特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体,其中11株人源抗体结合基因工程重组的SARS病毒核(N)蛋白,其中的1株在Westernblot分析中与SARS病毒结合,识别SARS病毒N蛋白线性位点。对所获抗体的功能鉴定及基因分析正在进行中。人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得,将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径。
- 杜润蕾于建石梁米芳刘琴芝李川韩露露段淑敏周为民张全福王涛毕胜利李德新
- 关键词：严重急性呼吸综合征SARS病毒基因工程抗体FAB抗体抗体库
- 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立被引量：4
- 2012年
- 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国新发现的一种布尼亚病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征。我们利用RNA聚合酶Ⅰ体系,分别构建SFTSV三个片段L、M、S微复制子,研究其非编码区调控功能。将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶(Luciferase)分别插入SFTSV三个片段5′和3′非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶I的表达载体pHH21中,获得SFTSV微复制子重组质粒L-GFP-pHH21、M-GFP-pHH21、S-GFP-pHH21、L-Luc-pHH21、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21,分别与成功表达SFTSV聚合酶蛋白(L蛋白)和结构蛋白(N蛋白)的质粒VR1012-L和VR-1012-NP共同转染293T细胞,24～48h后观察GFP表达情况或检测萤光素酶表达量。L、M、S片段GFP微复制子均可观察到特异性绿色荧光。荧光素酶定量结果显示其在不同节段非编码区中的表达量不同,提示SFTSV三个节段的非编码区启动微复制子转录和复制的强度不同。
- 于霞丽姜晓林王涛孙玉兰张硕李川张全福梁米芳毕振强李德新
- 关键词：发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒反向遗传学报告基因
- 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究被引量：26
- 2011年
- 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。SFTS新布尼亚病毒全基因组已解析,但病毒分子生物学结构蛋白特征及功能尚需更多研究。本文通过蔗糖密度梯度离心确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(HB29株)病毒颗粒的沉降密度及超离纯化条件,得出该病毒颗粒在蔗糖中的沉降密度为1.135g/mL。利用PCR方法扩增SFTSV病毒株HB29株病毒RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体蛋白(M)、包膜糖蛋白(Gn)、包膜糖蛋白(Gc)、核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)的编码区基因片段,分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT或VR1012,在293T细胞上获得上述基因表达。通过SDS-PAGE分析纯化病毒颗粒和重组蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光(IFA)确定蛋白活性和分子量。本研究结果将有利于对新布尼亚病毒分子生物学特征的认识,为后期研究提供基础。
- 卢静李川张福顺芜为张全福张黎王涛王芹仇佩虹梁米芳李德新
- 关键词：发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒蛋白表达
- 抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的构建和稳定表达被引量：1
- 2003年
- 目的 在内质网和细胞质内表达抗汉坦病毒糖蛋白G1,G2细胞内抗体。方法 PCR分别扩增抗汉坦病毒糖蛋白抗体VH和VL段基因 ,克隆入单链抗体表达载体pOPE 10 1 2 15 (Yol) ,转化大肠埃希菌XLI Blue ,IPTG诱导表达并鉴定其活性 ,再将单链抗体基因克隆入真核表达载体pEF myc ER和pEF myc CYTO ,转染VeroE6 ,使单链抗体在内质网和细胞质内得到表达 ;通过G4 18和有限稀释法筛选阳性克隆 ,建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系。结果 Western blot检测证实原核表达单链抗体 ,ELISA ,IFA检测其具有抗原结合活性 ,真核表达显示内质网和细胞质内特异性荧光 ,筛选细胞系阳性率 >95 %。结论 成功建立稳定表达抗汉坦病毒糖蛋白细胞内抗体的细胞系 ,为利用汉坦病毒细胞内抗体研究抗病毒作用和病毒的包装复制及病毒感染机制奠定良好基础。
- 王涛李建东李川梁米芳李德新
- 关键词：汉坦病毒糖蛋白抗体克隆肾综合征出血热
- 人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制被引量：1
- 2003年
- 目的 运用噬菌体表面表达技术 ,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA ,逆转录cDNA ,聚合酶链反应扩增人IgGFab轻、重链基因 ,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段 ,并在E coli中进行分泌性表达。通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体 ,并进行序列测定。然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC L Fc上 ,转染昆虫sf 9细胞 ,利用杆状病毒 昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达 ,免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白。结果 分离到一株Fab克隆AAVs 31,腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性 ,间接免疫荧光试验呈阳性 ,序列分析结果表明是一新的序列 ,所获得的基因为人源IgGFab基因 ,由Gamma链和Kappa链组成。表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性 ,免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒 ,不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白。结论 用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段 ,并在真核系统中表达了其全抗体 。
- 姚李四王涛梁米芳袁振华纪燕吴小兵李德新
