王静
- 作品数：10 被引量：65H指数：5
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划陕西省自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究被引量：10
- 2010年
- 为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。
- 何雷张彦明徐彦召唐青海王静杨小云代晨向华常鹏祥林鸷
- 关键词：猪瘟病毒E2基因猪白细胞介素2重组腺病毒
- 猪A组轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：10
- 2012年
- 本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件。建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90%,扩增相关系数大于0.98。对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强。该方法批内和批间变异系数均小于2%,重复性好。结果表明,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持。
- 高婉俊王静林鸷曹伟伟张彦明
- 关键词：A组轮状病毒SYBR实时荧光定量PCR
- 新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定被引量：23
- 2010年
- 为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6~7 d明显增殖,10~12 d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形,间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。
- 王静张彦明仝钢刘芳宁周宏超何雷杨小云徐彦召洪海霞
- 关键词：组织块培养原代培养
- 猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达被引量：4
- 2009年
- 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。
- 徐彦召张彦明何雷唐青海代晨王静杨小云
- 关键词：真核表达
- 猪轮状病毒NSP4的细胞定位及在细胞凋亡中的作用被引量：1
- 2015年
- 为研究猪轮状病毒非结构蛋白NSP4的细胞定位及其蛋白功能,将构建的重组质粒pNSP4-EGFP,pviroporin-EGFP和pEGFP-N1空载体质粒转染到SIEC02细胞株,通过与内质网定位蛋白的共聚焦分析、实时荧光定量PCR检测和Western blot分析,发现NSP4主要分布于内质网,少数定位于细胞核;NSP4蛋白可显著上调Bax基因水平(P<0.01)和caspase-3蛋白表达水平。说明猪轮状病毒NSP4蛋白具有类似viroporin的功能,主要定位于内质网上;NSP4依赖或部分依赖caspase的激活和Bax的活化促进细胞凋亡。
- 建琛瑶王静董望张彦明
- 关键词：猪轮状病毒非结构蛋白细胞凋亡NSP4
- 猪小肠黏膜上皮细胞原代培养被引量：6
- 2009年
- 分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。
- 王静张彦明周宏超
- 关键词：原代培养组织块培养纯化
- 表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用被引量：3
- 2010年
- 以猪白介素2基因(pIL-2)为研究对象构建表达pIL-2的重组腺病毒,并研究其作为细胞因子佐剂的免疫增强作用。用RT-PCR的方法扩增pIL-2基因,将pIL-2基因克隆到腺病毒穿梭载体AdTrack中,构建出重组腺病毒穿梭质粒AdTrack-pIL-2,然后在大肠杆菌BJ5183内和骨架载体AdEasy同源重组,获得重组腺病毒骨架载体AdEasy-pIL-2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-pIL-2,并通过兔体交互试验来检测Ad-pIL-2的免疫增强作用。经PCR、RT-PCR和Western blot检测,成功构建了Ad-pIL-2,病毒滴度可以达到108.25pfu/mL,并通过兔体交互免疫试验证明Ad-pIL-2可以提高兔的抗体水平。用腺病毒构建的Ad-pIL-2在兔体上具有免疫增强作用,为下一步的猪体试验研究和细胞因子佐剂的开发奠定基础。
- 何雷张彦明向华唐青海徐彦召杨小云王静代晨
- 关键词：重组腺病毒细胞因子佐剂
- 新疆北疆部分地区猪附红细胞体与圆环病毒混合感染的诊断被引量：3
- 2009年
- 分别采集60份新疆北疆地区部分规模化猪场疑似感染PCV-2和附红细胞体病死猪的肺脏及血液,利用PCR方法检测PCV-2部分基因序列,瑞氏染色后光学显微镜观察附红细胞体。结果显示,60份肺脏中,PCV-2阳性29份,阳性率为48.3%,60份猪血涂片中42份呈现附红细胞体感染,阳性率为70%。检出PCV-2的阳性猪血中有25份附红细胞体镜检阳性,说明PCV-2与附红细胞体存在共同感染。
- 胡广东李尚华马勋王静
- 关键词：猪圆环病毒2型附红细胞体
- 猪瘟病毒促进细胞自噬并利于病毒增殖被引量：7
- 2014年
- 细胞自噬在病毒的增殖、释放中有着重要的作用,目前国内仍然没有猪瘟病毒与细胞自噬相互作用关系的报道。本研究旨在探讨猪瘟病毒Shimen株感染宿主细胞(ST)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过透射电镜和自噬体标记分子LC3的荧光聚点的观察,直观判断病毒对自噬的影响;并通过Western blot,检测LC3蛋白和P62蛋白的表达量,以及LC3蛋白转化分析,确定猪瘟病毒感染促进细胞自噬发生。利用自噬促进剂雷帕霉素、抑制剂3-MA、自噬体与溶酶体融合阻断剂氯喹(CQ),以及自噬基因Beclin 1、LC3蛋白的干扰,调控自噬来研究自噬对病毒增殖的影响。结果表明,病毒感染细胞促进了细胞自噬的发生,且能形成完整的自噬过程,同时病毒利用细胞自噬来促进自身增殖。本研究为探索猪瘟病毒与宿主细胞相互作用关系增加了新的数据。
- 康恺林鸷高海慧张成成李河林梁武龙王静曹志张彦明
- 关键词：猪瘟病毒细胞自噬病毒增殖自噬相关基因
