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一种重组杆状病毒快速无缝克隆的方法: <正>昆虫杆状病毒因其极晚期基因(ph和p10)启动子可以强效驱动外源基因表达而常用于构建重组病毒高效表达目的蛋白,现发展出各种类型的杆状病毒载体表达系统(Baculovirus expression vector sy...; 钱月忠史翠萍郝雪敏陈健; 关键词：重组杆状病毒基因表达; 文献传递

基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法: 2014年; 研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。; 梅文枫钱月忠史翠萍陈健; 关键词：杆状病毒共转染绿色荧光蛋白

一种快速稳定构建重组杆状病毒的方法: 2016年; 快速稳定地将外源基因插入杆状病毒基因组获得重组杆状病毒,是提高昆虫杆状病毒表达系统应用效率的关键技术之一。在Ac Bacmid的基础上,通过λRed同源重组技术敲除病毒基因组lef2和orf1629基因的3＇端部分序列获得RDAc Bacmid-DualKo,并用Bsu36Ⅰ线性化之后,经重叠PCR获得5＇端和3＇端各含有50 bp同源臂及以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为外源基因的表达盒片段,再将线性化杆状病毒载体片段与表达盒片段共转染sf9细胞,3~4 d即可获得重组杆状病毒rvAcBacmid-GFP。SDS-PAGE和Western blot结果表明,被rvAcBacmid-GFP感染的sf9细胞能高效表达绿色荧光蛋白。该方法通过线性化复制缺陷型杆状病毒载体和携带有同源臂及外源基因的重叠PCR片段,在胞内完成同源重组获得重组杆状病毒,避免了繁琐的病毒空斑纯化和分子克隆操作,获得的重组杆状病毒中无不稳定因子BAC及影响下游应用研究的抗性基因,为快速构建重组杆状病毒高效表达外源基因及相关研究应用提供了新的技术平台。; 郝雪敏钱月忠史翠萍陈健; 关键词：重组杆状病毒同源重组绿色荧光蛋白

一种红色荧光蛋白基因稳定转化的家蚕细胞株构建及应用: 2013年; 构建一种红色荧光蛋白基因稳定转化的家蚕细胞株,用于检测细胞是否被家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染和快速、便捷地测定BmNPV滴度。首先构建BmNPV多角体蛋白基因(polh)启动子驱动的红色荧光蛋白基因(DsRed)表达盒,然后将该表达盒克隆至pIZT/V5-His中构建稳定转化载体pIZT-DsRed并转染家蚕卵巢上皮细胞BmN,经过终浓度为300μg/mL的博莱霉素(zeocin)筛选3个月后,最终获得DsRed稳定转化的家蚕细胞株BmN-RFP。当该细胞株感染BmNPV后,由于病毒晚期表达因子的活化引发polh启动子控制的DsRed表达,在荧光显微镜下可以观察到感染病毒的细胞发出红色荧光,因而BmN-RFP可用来指示BmNPV的感染。利用BmN-RFP细胞株,采用终点稀释法仅用3 d时间即可完成BmNPV滴度的测定。; 陈和陈琴梅文枫钱月忠聂作明于威陈健张耀洲; 关键词：红色荧光蛋白家蚕核型多角体病毒病毒滴度

杆状病毒介导的噬菌体Lambda-Red样重组及其应用: λ-噬菌体Red重组是由λRed操纵子三个基因（Redα、β、γ）编码的蛋白酶所介导的同源重组，通常这种重组发生在大肠杆菌细胞中线性DNA与环状DNA分子之间。外切核酸酶α消化DNA片段的5’端产生突出的3’端单链，该单...; 钱月忠; 关键词：杆状病毒; 文献传递

一种基于无缝克隆构建重组杆状病毒的方法: 2017年; 一些病毒复制过程涉及到断裂双链DNA的修复,主要有同源重组和非同源的末端连接2种修复形式。基于这种修复机制建立了构建重组杆状病毒的无缝克隆方法,采用该方法构建重组病毒的2个主要元件是:线性化的复制缺陷型杆状病毒载体和重组拯救DNA片段。杆状病毒载体经Bsu36Ⅰ酶切后产生2个末端,即切短了的orf1629 3'末端和细菌人工染色体(BAC)末端。其中,含克隆目的基因的重组拯救DNA片段通过同源臂同源重组修复病毒载体orf1629缺失的3'端序列,并通过细胞内的非同源末端连接修复细菌人工染色体片段(BAC)Kanr末端,从而使载体环化产生重组杆状病毒。应用该方法构建重组杆状病毒无需构建重组载体,无需进行重组后筛选,具有成本低、效率高的特点。; 钱月忠郝雪敏史翠萍陈琴何玉龙陈健; 关键词：线性化重组杆状病毒

复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用: 本发明公开了利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid，进而通过Red重组技术构建了一种复制缺陷型的BmNPV载体。复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法具体为：首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBa...; 陈健陈琴费伟强钱月忠于威吕正兵; 文献传递

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钱月忠