宋慧芳
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
- 供职机构：山西大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山西省科技基础条件平台建设计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 飞蝗dsRNA降解酶对RNA干扰效率的影响机制
- RNAi(RNA interference)是dsRNA介导的一种转录后基因沉默现象，RNAi技术自发现以来已被广泛应用于基因功能的研究，近年来国际上普遍认为基于RNAi的害虫防治技术在植物保护领域具有潜在的应用价值。然...
- 宋慧芳
- 关键词：飞蝗RNA干扰
- 文献传递
- 飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析被引量：9
- 2016年
- 【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac^(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显
- 宋慧芳李应龙马恩波张建珍
- 关键词：飞蝗蛋白表达酶学特性
- 飞蝗双链RNA降解酶的抗体制备及组织定位被引量：2
- 2018年
- 【目的】双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme, dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2'、R3')进行后续的研究。根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L^(-1),37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2'和R3'蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2'和R3'设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L^(-1)条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2'蛋白,可直接用于免疫;而R3'蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大�
- 宋慧芳张建琴张建琴李涛李涛张建珍
- 关键词：飞蝗多克隆抗体
- 一种飞蝗肠道核酸水解酶基因在害虫防治中的应用
- 本发明提供飞蝗核酸水解酶基因2(RNase 2)在农业害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取RNase 2片段，进一步通过PCR扩增验证获得其cDNA全长序列。据此设计引物并合成RNase 2的双...
- 张建珍宋慧芳张建琴刘晓健李涛马恩波
- 文献传递
- 一种飞蝗肠道核酸水解酶基因在害虫防治中的应用
- 本发明提供飞蝗核酸水解酶基因2(RNase 2)在农业害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取RNase 2片段，进一步通过PCR扩增验证获得其cDNA全长序列。据此设计引物并合成RNase 2的双...
- 张建珍宋慧芳张建琴刘晓健李涛马恩波
- 文献传递
