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草鱼白介素10基因的克隆表达及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立: 2021年; 为建立检测草鱼白介素10(Ci IL-10)的双抗体夹心ELISA方法,首先克隆Ci IL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒p ET-32a-Ci IL-10,并对表达产物进行纯化,以获得重组Ci IL-10(r Ci IL-10)纯化蛋白。然后,以纯化的r Ci IL-10蛋白为免疫原制备兔源及鼠源抗r Ci IL-10的多克隆抗体,并对其进行纯化与酶标记。最后,以纯化的鼠抗r Ci IL-10抗体为捕获抗体,r Ci IL-10纯化蛋白为夹心抗原,HRP标记的兔抗Ci IL-10纯化抗体为检测抗体,通过优化反应条件,建立双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的优化反应条件包括,捕获抗体的最佳包被浓度为20μg·m L^(-1),检测抗体的最佳稀释度为1∶3 200,最佳封闭条件是使用5%脱脂奶粉,37°C封闭1.5 h,样品反应时间为2h,以OD450值≥0.174作为阳性判定标准。该方法的板内及板间重复性变异系数小于10%,最低检测限量为24.29ng·m L^(-1),与草鱼白介素6、草鱼肿瘤坏死因子、小鼠白介素10、小鼠干扰素和小鼠单核细胞趋化蛋白均无交叉反应。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度,可用于草鱼白介素10的快速检测。; 胡忠俊周昊吕丽丽李槿年; 关键词：抗体制备双抗体夹心ELISA

克氏原螯虾病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏与黏附特性被引量：25: 2016年; 为了明确安徽省当涂县淡水养殖克氏原螯虾暴发性疾病的病原,取濒临死亡的病虾分离病原。从肝胰腺中分离到一株优势细菌（命名为XLX1分离株）,人工感染试验证实其具有较强的致病性;采用形态学检查、生理生化特性测定和细菌16S r RNA基因序列分析,确定XLX1分离株为弗氏柠檬酸杆菌。进一步对XLX1分离株进行药物敏感性、携带黏附素基因情况和细胞黏附性进行检测。结果显示：该分离株对头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、替考拉宁和米诺环素敏感或中敏,对其他7种测试药物呈现耐药。该分离株携带黏附素基因cfa和ure基因簇;序列分析发现ure ABC结构基因和ure D关键辅助基因高度保守,在虾源分离株与人源参考株间前者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在93.2%～98.3%和91.7%～97.4%,后者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在90.8%～98.3%和94.7%～98.7%;与人源参考株相比,虾源分离株Ure ABC结构蛋白中第294、600和608位氨基酸,以及Ure D蛋白中的第62和122位氨基酸发生了有意突变。XLX1分离株可以聚集方式黏附于EPC细胞周围,平均黏附菌数为29.8±5.3,但随黏附时间延长,EPC细胞出现病变。上述研究结果可为防控弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物疾病提供理论依据。; 肖宁孔令严周昊曹际李槿年相翊卿王蒙蒙; 关键词：克氏原螯虾药敏性黏附性

拟态弧菌VMH蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备被引量：2: 2016年; 目的实现拟态弧菌热不稳定性溶血素(VMH)的原核表达,制备兔抗VMH蛋白的多克隆抗体。方法根据GenBank上已有的拟态弧菌vmh基因序列,设计并合成引物,通过PCR方法扩增vmh基因。PCR纯化产物酶切后,定向插入到PET-32a表达载体构建重组表达质粒PET-32a-vmh。重组表达质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下进行VMH蛋白表达。SDS-PAGE分析重组VMH蛋白(rVMH)的表达形式,并分别采用兔血平板扩散法和Western blot检测其溶血活性和免疫反应性。用纯化的rVMH蛋白免疫新西兰大白兔,3次免疫后采集免疫血清,采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法纯化多克隆抗体,并检测其纯度与效价。结果重组表达质粒PET-32a-vmh诱导表达后,经SDS-PAGE分析发现分子量约为77.8kDa的rVMH蛋白主要以包涵体形式表达,该蛋白经变性复性后具有溶血活性和免疫反应性。兔抗rVMH蛋白的多克隆抗体经纯化后,其纯度达95%,ELISA效价为1∶26843545600,琼扩效价为1∶32。结论成功制备了rVMH蛋白及其多克隆抗体,为进一步采用噬菌体肽库筛选技术鉴定VMH蛋白表位提供了物质基础。; 肖宁曹际孔令严周昊陶会竹陶丽寒李槿年; 关键词：拟态弧菌原核表达多克隆抗体

基于Iclp的拟态弧菌OmpU_(AP)真核表达重组质粒的构建及其免疫效果初步评价: 2017年; 为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。; 刘艳丁淑荃陶会竹曹际周昊李槿年; 关键词：拟态弧菌免疫效果

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周昊

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