田磊
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
- 供职机构：四川大学生命科学学院微生物与代谢工程四川省重点实验室更多>>
- 发文基金：四川省自然科学基金国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
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- 播娘蒿耐寒基因DsKIN1的克隆、序列分析及冷诱导表达分析
- 2017年
- 播娘蒿是极端耐寒的冷诱导植物,研究其低温胁迫下的冷响应基因对于揭示其抗寒性具有重要意义.根据拟南芥At KIN1和At KIN2同源比对,设计同源引物进行播娘蒿KIN基因克隆,通过RACE技术克隆得到Ds KIN1基因,利用Vector NTI11.5软件对其进行序列分析,采用Realtime-PCR测定Ds CBF1、Ds CBF2、Ds COR和Ds KIN1基因在不同处理方式[整株低温处理、同一植株局部低温处理和局部未受低温处理(两部分植株)]下各时间段(0.2 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h)的表达,采用String数据库预测分析与Ds KIN1相互作用的蛋白.结果显示,Ds KIN1基因序列全长为462 bp,开放阅读框ORF长度为198 bp,编码66个氨基酸,分子量(Mr)为6.61×10~3,理论等电点为9.10,亲水性好.播娘蒿Ds CBF1和Ds CBF2在0.2 h开始表达,在2 h达到最大,随后下降.在冷诱导0.2 h后,Ds CBF调控的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1基因开始表达,均呈现上调的趋势.整株、局部冷诱导植株与同一植株上未受低温胁迫部位的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1表达模式类似.此外发现与Ds KIN1相互作用的蛋白大部分为低温诱导蛋白、盐和渗透压胁迫响应的信号蛋白、与渗透调节有关的家族蛋白、RING-H2锌指蛋白2B以及未知蛋白等.本研究说明播娘蒿局部冷诱导时,冷信号可进行传递,使未受冷诱导部位获得耐寒性能.
- 田磊常斐斐秦世尚唐滋一陈麒名马晓瑞徐辉乔代蓉曹毅
- 关键词：播娘蒿基因克隆低温胁迫
- 播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的EMSA试验分析被引量：3
- 2016年
- CBF(C-repeat binding factor)是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子,可与下游冷应答基因启动子的核心序列CBT/DRE元件(CCGAC)特异性地结合,启动耐寒基因的表达,提高植物的抗寒能力.为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)的抗寒机制,研究播娘蒿转录因子Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒基因表达的作用.首先分析Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性,设计重叠延伸PCR引物,定点突变Ds CBF1基因;然后构建p ET32a-Ds CBF1突变体原核表达载体,通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达,并通过镍离子亲和层析纯化Ds CBF1突变体蛋白;最后利用化学发光法EMSA试验(Electrophoretic mobility shift assay)方法分析Ds CBF1蛋白与含有CRT/DRE元件的DNA探针之间的相互作用.EMSA试验分析显示,播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)分别突变为精氨酸R(CGT)和谷氨酸E(GAA),导致播娘蒿顺式调控因子Ds CBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势,说明播娘蒿Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力.本研究表明播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用.
- 陈麒名常菲菲李茜刘博田磊陈天盈徐辉乔代蓉
- 关键词：播娘蒿重叠延伸PCREMSA
- 表达外源DsCOR转基因拟南芥的筛选及其抗寒性被引量：2
- 2016年
- 为验证播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能,在实验室前期DsCOR基因大量研究的基础上,本研究通过农杆菌介导花序浸染法把诱导型表达载体PBI121-DsCORpro681-DsCOR转入COR15a缺陷型拟南芥中(A-S),筛选获得转DsCOR基因阳性苗(A-I),并测定了A-I、A-S和野生型(A-W)拟南芥在4℃低温胁迫下的叶片脯氨酸含量、电解质渗透率和幼苗在-4℃下存活率等抗寒生理指标;使用Real-time quantitative RT-PCR检测A-I在低温胁迫下DsCOR基因的表达规律.结果显示,A-W和A-I两种植株叶片脯氨酸含量在低温处理过程中显著增加,从处理前70μg g^(-1)到处理后12h分别升至453μg g^(-1)和406μg g^(-1)并趋于稳定,A-S叶片脯氨酸含量变化不大(30^(-1)05μg g^(-1)).随着处理时间增加,A-S叶片电解质渗透率升高较明显,36 h后达到45.2%;而A-W和A-I两种植株叶片电解质渗透率最高分别达到14.3%和16.3%.幼苗存活率统计结果显示,A-S缺失COR15a后,在-4℃处理后该株系幼苗全部死亡,而A-W和A-I两个株系都有较高的存活率,分别达到53%和83%.抗寒生理指标结果表明转DsCOR基因拟南芥的抗寒能力已得到显著提高,达到野生型拟南芥水平.Real-time quantitative RT-PCR检测显示DsCOR基因在A-I中表达明显受到低温胁迫诱导.综上,DsCOR基因在COR15a缺陷型拟南芥中实现了成功表达,并显著提高了其抗寒性,最终验证了播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能.
- 林强陈麒民田磊乔代蓉
- 关键词：播娘蒿转基因拟南芥低温胁迫
