刘华伟
- 作品数：4 被引量：5H指数：1
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应被引量：4
- 2016年
- 【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用Clustal X1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta(DE3)菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1—17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 k D,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达,且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表�
- 刘华伟李游山唐新张晓璐赵萍
- 关键词：家蚕丝氨酸蛋白酶中肠饥饿
- 家蚕clip丝氨酸蛋白酶BmSP95在蜕皮过程的表达与功能
- 分析家蚕(Bombyx mori)蜕皮液中clip 丝氨酸蛋白酶的表达情况，并以clip 丝氨酸蛋白酶BmSP95 为靶标，探究其在蜕皮过程中的表达与功能。利用LC-MS/MS 对家蚕幼虫-蛹和蛹-成虫期的蜕皮液组分进行...
- 刘华伟夏庆友赵萍
- 关键词：家蚕20-羟基蜕皮酮
- 家蚕丝腺中Abd-A 3种剪接体的克隆、序列分析及原核表达
- 2022年
- 为探究转录因子Abdominal-A(Abd-A)在家蚕丝腺中的剪接形式及其序列特征,明确与其他昆虫Abd-A的亲缘关系,以家蚕丝腺组织cDNA为模板,对转录因子Abd-A进行PCR扩增,利用生物信息学方法,对Abd-A的序列特征以及不同昆虫间Abd-A的进化关系进行分析;并通过原核表达系统对Abd-A进行体外重组表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测其蛋白质表达水平。结果显示,从家蚕丝腺中克隆到Abd-A的3种剪接体,其编码区长度分别为1059、1044、1032 bp,分别命名为BmAbd-A L(A59T)、BmAbd-A S、BmAbd-A 3。不同昆虫Abd-A的多序列比对结果表明,它们的氨基酸序列差异较大,但都具有DNA结合结构域Homeobox domain和转录激活结构域Abd-A domain,其中Homeobox domain序列完全保守,而Abd-A domain的羧基端序列存在较大差异。三维结构预测结果表明,Abd-A的3种剪接体编码蛋白质中均有4个α螺旋结构和无规则卷曲结构,其中无规则卷曲结构差异较大。系统发育分析结果表明,35种不同昆虫的Abd-A编码的氨基酸序列主要分为4个目,分别为双翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目,家蚕的Abd-A氨基酸序列与大蜡螟(鳞翅目:螟蛾科)在进化关系上更近,其次为玉米螟。SDS-PAGE及Western blot分析表明,BmAbd-A L(A59T)、BmAbd-A S、BmAbd-A 3的融合蛋白主要以可溶形式在大肠杆菌中表达,其理论分子质量分别为52.99、52.35、51.91 ku,与预期一致。综上,从家蚕丝腺中成功克隆到Abd-A的3种剪接体,它们的序列及三维结构间具有差异性,其分子进化过程与物种系统进化一致,并利用原核表达系统获得可溶性的Abd-A重组蛋白。
- 路庆君罗竹星刘华伟魏梦王圆张照锋李游山
- 关键词：家蚕丝腺剪接体原核表达
- 家蚕核转录因子NF-κB对不同细胞系中免疫相关基因表达的调控分析被引量：1
- 2024年
- 昆虫Toll和免疫缺陷(immune deficiency,IMD)信号通路在进化上非常保守,主要通过核转录因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)调节抗菌肽等免疫相关基因的表达。然而,关于家蚕NF-κB转录因子Rels和Relish对抗菌肽等免疫相关基因表达调控的差异目前尚未见系统报道。本研究克隆了家蚕BmRelA、BmRelB和BmRelish1基因,并构建了它们的真核细胞过表达载体。将重组载体分别转染家蚕BmE和BmN细胞后,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测了抗菌肽及免疫相关基因的表达变化。结果表明,家蚕抗菌肽基因Defensin2和Gloverin2的表达主要受Relish1调控,Moricin的表达主要受RelA和RelB调控,其他抗菌肽的表达则受二者共同调控。此外,家蚕肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)、β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition proteins,βGRPs)、溶菌酶(lysozymes,Lys)、类溶菌酶蛋白(lysozyme and lysozyme-like proteins,LLPs)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)等蛋白的编码基因均响应Rels和Relish的诱导,在不同细胞系中不同程度上调表达,提示这些分子的表达也受到Toll或IMD通路的调节。相比于果蝇Toll和IMD信号通路转录因子对抗菌肽基因表达调控具有特异性,本研究发现家蚕Rels和Relishl对抗菌肽基因表达的调控模式更为复杂,为进一步解析昆虫Toll和IMD通路的效应机制和反馈机制提供了实验依据。
- 徐佳卉刘华伟孙小桐唐章晨黄敏赵萍
- 关键词：转录调控
