张涛
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 毛细管电泳技术在聚乙二醇化蛋白药物质量控制中的应用
- 2015年
- 毛细管电泳是一种以高压电场为驱动力,熔融石英毛细管为分离通道的液相微分离技术。该技术样品消耗量少,分离模式灵活多样,能够检测氨基酸、多肽、蛋白质、细胞、病毒颗粒等多种生物样品,较高效液相色谱有更强的样品适应性。目前,该技术呈现了与其他分析技术联用,检测体系芯片化,检测通量不断提高的发展趋势。蛋白分子异质性分析是蛋白质药物质量控制的重要方面。由于聚乙二醇分子本身具有一定程度的异质性,蛋白聚乙二醇化的过程也有可能引入新杂质,因此聚乙二醇化蛋白药物异质性分析更加必要。聚乙二醇修饰蛋白药物质量控制需要说明蛋白质上连接聚乙二醇分子的数量和位置,即需要检测蛋白的聚乙二醇修饰率和聚乙二醇修饰位点。通过回顾近几年毛细管电泳在聚乙二醇化蛋白药物质量控制中的应用,说明不论是传统毛细管电泳系统还是芯片毛细管电泳系统都能够实现多种蛋白药物聚乙二醇修饰率检测,通过毛细管电泳与质谱联用也能够分析蛋白药物聚乙二醇修饰位点。毛细管电泳与应用非常广泛的分子排阻色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,具有分离效果好,分析速度快,定量准确的优势。综上所述,毛细管电泳技术是聚乙二醇化蛋白药物质量控制的一种重要技术手段,在聚乙二醇化蛋白质量控制方面具有广阔的应用前景。
- 张涛王明蓉
- 关键词：毛细管电泳聚乙二醇化毛细管区带电泳
- 多糖样品中微量蛋白含量检测方法的验证被引量：1
- 2018年
- 目的验证多糖样品中微量蛋白的Micro-BCA检测方法。方法根据分析方法质量源于设计(the quality of analytical method is derived from design,AQb D)的开发流程,选择Micro-BCA法进行多糖微量蛋白含量的检测,并对方法的专属性、精密性及准确度进行验证,确定方法的检测限(detection limit,DL)及定量限(quantitative limit,QL)。结果多糖样品不影响该方法的检测,选择无机盐类纯化缓冲液,通过使标准品与样品的基质均一化,可消除基质效应,得到准确的检测效果。BSA浓度在10~40μg/mL范围内线性良好,线性相关系数(R^2)> 0. 99;试验内及试验间检测结果的相对标准偏差(RSD)均<3%;试验内及试验间回收率均在(100±5)%之间;重复3次检测DL均值为0. 4μg/mL,QL均值为1. 1μg/mL。结论多糖样品微量蛋白Micro-BCA检测方法的检测通量高,与工艺缓冲液兼容性好,且具有良好的精密性及准确度。
- 何勇智张涛
- 关键词：多糖微量蛋白
- ELISA法测定大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度及药代动力学研究被引量：1
- 2016年
- 目的:建立一种检测大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度的ELISA方法,并进行该蛋白的药代动力学初步研究。方法:以该蛋白的多抗包被,标记生物素的单抗检测,生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶两级酶联放大检测信号,构建双抗夹心ELISA法进行浓度检测。通过对包被抗体和检测抗体工作浓度的优化实验,血清基质的干扰实验,不同结构聚乙二醇分子的比较实验,建立该方法的基本实验条件。并参考相关法规,对其方法特异性、准确度、精密度、耐用性、检测限度以及样品稳定性进行验证。分别用PEG-SOP55_(30kDa)、PEG-SOP55_(40kDa)、PEG-SOP55_(40kDa branched)进行Lewis大鼠腹腔单次给药然后测定血清浓度,获得该蛋白用不同分子结构聚乙二醇分子修饰后的药代动力学参数。结果:实验证实聚乙二醇修饰降低了检测抗体和目标分子的结合效率,且大鼠血清和聚乙二醇分子结构变化对检测有干扰。通过提高包被抗体浓度,获得对目标分子较好的捕获效率。通过将血清样品稀释液从PBS替换为咪唑缓冲液,且保持标准曲线和待测样品血清稀释倍数一致,克服了血清基质所带来的干扰。通过保持标准曲线和待测样品聚乙二醇分子结构一致,克服了因聚乙二醇分子结构不同带来的干扰。方法验证结果表明该方法特异性良好,回收率为(100±15.2)%,实验内精密度和实验间精密度验证数据RSD均不超过20%,不同操作人员对检测结果无显著影响,标准曲线线性良好,标准曲线的最高和最低浓度能够准确测定。将大鼠血清样品反复冻融3次,在室温放置4 h其稳定性均符合要求,满足该方法检测条件。通过对Lewis大鼠血清样品进行浓度测定,获得PEG-SOP55_(30kDa)、PEG-SOP55_(40kDa)、PEG-SOP55_(40kDa branched)的药代动力学参数。其C_(max)分别为31.9、54.4、67.7 mg·m L^(-1),AUC_(0-∞)分别为823.0、1 978.0、3 502.6 mg·h·m L^
- 张涛何静李坤王明蓉
- 关键词：聚乙二醇化重组蛋白药代动力学
- Anti-IgE单链抗体纯化工艺研究及活性鉴定被引量：1
- 2015年
- 目的:建立anti-IgE单链抗体纯化工艺并对其活性进行鉴定。方法:根据protein L亲和层析填料和Ni亲和层析填料的特点分析,经初筛后选用protein L填料作为第一步初纯化填料,Ni亲和层析填料作为第二步精细纯化填料。通过对这两种纯化方式的上样条件和洗脱条件进行研究,建立了anti-IgE单链抗体的纯化工艺。结果:protein L亲和层析的初纯化工艺:最佳杂质洗涤pH=3.5,最佳目标蛋白洗脱pH=2.0,并且pH=2.0洗脱的目标蛋白收集在第二步Ni亲和层析的上样缓冲液中,可直接进行第二步Ni亲和层析纯化。所建立的Ni亲和层析精细纯化工艺:最佳杂质洗涤为50mmol/L咪唑,最佳目标蛋白洗脱为500mmol/L咪唑。经两步亲和纯化,目标产物在SDS-PAGE上纯度为99.0%,CE-SDS上纯度为99.5%,两步总收率为80.0%。纯化后的蛋白经竞争ELISA和Biacore检测,证实该产品特异性识别IgE靶标,与IgE靶标的亲和力达到8.59e^(-9)M,并且竞争Biacore结果显示该抗体对IgE有良好的中和活性,其抑制IgE的EC50值为70n M。结论:建立了一种高效、简洁的大肠杆菌表达的anti-IgE单链抗体纯化工艺,为其进一步规模放大工艺的建立奠定了基础。同时证明了该新型小分子anti-IgE抗体对靶标具有良好的特异性、亲和力以及中和活性,并展示出其在医用中的应用价值。所建立的小分子抗体纯化工艺技术对其他小分子单链抗体的纯化具有参考价值。
- 代云见张勇侠何勇智丛聪张涛王明蓉
- 关键词：哮喘
