曹伯良
- 作品数：11 被引量：32H指数：3
- 供职机构：南京医科大学基础医学院病理学系更多>>
- 发文基金：南京医科大学科技发展基金江苏省社会发展科技计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- MET4和C-28检测胰腺癌MET蛋白表达的对比研究
- 2011年
- 目的:对比研究兔多抗C-28和鼠单抗MET4在胰腺癌组织中检测MET蛋白表达的差异性和相关性。方法:采用免疫组化间接法研究C-28和MET4检测67例胰腺癌组织中MET表达情况,定量图像分析MET4和C-28的检测效能。结果:MET4和C-28检测胰腺癌的阳性率分别为70.1%和71.6%。两种抗体检测MET阳性率无显著差异(χ2=0.980,P=0.387)。相关分析显示两者无显著相关性(r=-0.127,P=0.307),在C-28未检出的病例中有84.2%(16/19)MET4检出,在MET4未检出的病例中有85.0%(17/20)C-28检出。在无MET蛋白表达的胰岛和正常胰腺上皮中,C-28有染色,而MET4无染色。结论:相对C-28抗体,MET4用于检测胰腺癌MET蛋白表达具有较高的特异性。
- 郭振英彭韬李芸茜曹伯良
- 关键词：MET胰腺癌免疫组织化学
- 人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析
- 2009年
- 目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgGFc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc。所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Westernblot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价。结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合。结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备。
- 熊林张爱霞李芸茜张大为曹伯良朱进唐荣才
- 关键词：MET基因工程抗体融合蛋白
- HDGF真核表达质粒的构建、表达及其生物活性检测被引量：2
- 2010年
- 目的:构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,转入胶质瘤U87细胞中,对其表达及生物学活性进行检测。方法:PCR扩增HDGF编码区序列,构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,脂质体转染U87细胞,G418筛选稳定表达单克隆,荧光显微镜观察绿色荧光,RT-PCR及Westernblot检测融合蛋白在转染细胞中的整合及表达。通过U87细胞增殖实验对HDGF-GFP融合蛋白进行初步功能鉴定。结果:pEGFP-HDGF表达质粒转染U87细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR、Westernblot结果证实在U87细胞中有HDGF-GFP融合蛋白的表达。细胞增殖实验的结果显示,稳定表达pEGFP-HDGF的U87细胞生长速率明显高于对照空载组细胞(P=0.006)。结论:pEGFP-HDGF真核表达质粒构建成功,且HDGF对于胶质瘤U87细胞株有着生长刺激作用,这将有助于胶质瘤发生发展的分子机制研究。
- 郭泽龙卫国曹伯良张爱霞
- 关键词：肝癌衍生生长因子绿色荧光蛋白
- 探讨不同实验条件对U87细胞体外增殖的影响
- 2010年
- 目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS法检测细胞增殖能力。结果:HDGF表达水平下调后,U87细胞增殖能力受到抑制。在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,细胞增殖抑制率分别是18%、9%和28%。结论:在无血清Matrigel胶预先处理的培养条件下,能最大程度上反映出HDGFsiRNA对U87细胞增殖能力的抑制。
- 龙卫国郭泽曹伯良张爱霞
- 关键词：RNA干扰细胞增殖
- 鼠源性单克隆抗体Met4用于检测胃癌组织Met的表达及临床意义被引量：2
- 2010年
- 目的:观察研究肝细胞生长因子受体Met在胃癌组织及相对应的淋巴结转移灶中的表达水平,同时比较分析抗Met单克隆抗体Met4和多克隆抗体C28在检测Met表达水平中的差别。方法:采用免疫组织化学间接法检测胃癌组织芯片中Met表达水平,比较Met4与C28的检测效能。结果:Met在细胞膜及胞浆阳性表达率在不同病理分级组间无统计学意义(P>0.05)。Met4组Met的阳性染色部位于细胞膜(浆),而C28组Met阳性染色部位在细胞浆中,二者在Met亚细胞染色定位上有差别。Met4的阳性检出率(58.3%)高于C28阳性检出率(30.5%),具有统计学意义(P<0.05)。Met4组21例胃癌原发灶Met阳性病例中14例淋巴结转移灶Met表达阳性,C28组11例原发灶Met阳性病例中6例淋巴结转移灶Met表达阳性。原发灶中Met阳性表达与转移淋巴结中Met的阳性表达有显著相关性(P<0.05)。结论:Met阳性表达可能在肿瘤的淋巴转移过程起重要作用。Met4用于肿瘤的诊断及靶向治疗,具有良好的临床应用前景。
- 黄嫣郭振英彭韬张爱霞李芸茜曹伯良
- 关键词：MET胃癌组织芯片免疫组织化学
- 全人源抗Met双价抗体的制备与特性分析
- 2008年
- 目的以抗HGF受体Met特异性的全人抗体Fab基因为模板,合成并表达双价抗体Diabody。方法以天然抗体库中筛选出的Fab基因为模板,分别扩增抗体的重链可变区与轻链可变区基因,经重叠拼接合成Diabody基因,克隆于原核表达载体pBAD/gⅢA中表达。在不同的培养条件下,阳性克隆经IPTG诱导表达,ELISA、SDS-PAGE、Western-blot和细胞免疫荧光分析。结果培养基成分和诱导剂的浓度对目的蛋白的表达未见有明显的影响,低温诱导能够促进可溶性蛋白的产生;但电泳与印迹分析表明,在29kD出现预期大小蛋白条带。双价抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用细胞免疫荧光分析表明,Diabody能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合。结论本研究制备的双价抗体能够与其抗原特异性结合,该抗体有望与其他抗体分子结合,制备双特异性抗体,为肿瘤临床诊断或治疗提供候选分子。
- 徐凛峰朱进唐奇张大为曹伯良管晓虹
- 关键词：抗肿瘤药原癌基因蛋白质C-MET抗体
- 高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析被引量：7
- 2006年
- 目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。结果经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中,经诱导表达、SDS-PAGE和Westernblotting分析,在相对分子质量30000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力(Kd值为5.24×10-6mol/L)相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。结论经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。
- 朱进王辛焦永军冯振卿曹伯良管晓虹
- 关键词：噬菌体抗体库抗肿瘤
- 血管内皮生长因子及相关促肿瘤血管生成分子及靶向治疗被引量：10
- 2010年
- 1971年，Folkman首次提出了“肿瘤生长浸润依赖于肿瘤血管生成”的假说。此后，以肿瘤新生血管为作用靶点的抗血管生成治疗成为重要的抗肿瘤策略之一。2004年第一个抑制血管生成的药物贝伐单抗（Bevacizumab／Avastin）被美国食品药品管理局（FDA）批准上市，标志着抗肿瘤血管生成药物研究取得了阶段性成果。但是通过临床实践，我们发现抗血管生成单抗药物治疗效果欠佳，
- 郭振英曹伯良
- 关键词：抗肿瘤血管生成血管内皮生长因子靶向治疗分子肿瘤新生血管抑制血管生成
- 人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定
- 2010年
- 目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor proteinD52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定。方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a、pGEX-4T-2和pET-28a3种表达载体中。重组质粒经酶切鉴定、序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot、Western blot鉴定纯化蛋白的特性。结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform3型。用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合。结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性。
- 陈汐敏丁贵鹏冯振卿曹伯良
- 关键词：原核表达抗原性
- 可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析被引量：3
- 2007年
- 应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,一个与肿瘤发生、侵袭和转移相关原癌基因产物)特异性、高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CH1、CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,构建Fab次级抗体库.经细胞筛选和固相筛选,获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,在25ku和27ku出现预期大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、免疫沉淀、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与S114和MKN45细胞膜上的Met胞外区特异性结合,而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显示,Fab能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG结合,并进入细胞内,抑制Met阳性细胞的生长,揭示该抗体能够与Met特异性结合,并且被细胞内化.该抗体有望成为肿瘤临床诊断或治疗的候选分子.
- 朱进赵萍焦永军王昕曹伯良冯振卿管晓虹
- 关键词：肝细胞生长因子受体噬菌体抗体库
