王微
- 作品数：15 被引量：32H指数：4
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- 猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达被引量：2
- 2009年
- 用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。
- 王微解民吴凌娟靳慧君韩冬梅仲飞
- 绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在HEK293T细胞中的表达
- 采用 PCR 方法从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853菌株基因组扩增绿脓杆菌外毒素 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)全长编码基因,并...
- 吴凌娟仲飞解民靳慧君王微韩冬梅
- 文献传递
- 白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用被引量：6
- 2012年
- 犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12(IL-12)基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基(P40)和小亚基(P35)cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点(IRES)序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12(P40和P35双亚基)基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫(用pcDNA3.1A作为对照)。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P<0.01),抗体水平在第35天高达1:5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组(P<0.05)。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。
- 潘素敏李秀锦仲飞柳新保韩冬梅王幸兴潘宏丽王微
- 关键词：IL-12细小病毒VP2基因DNA疫苗
- 犬TfR胞外区密码子的优化、真核表达及与犬细小病毒VP2蛋白结合被引量：3
- 2009年
- 为制备大量具有天然活性的犬胞外区可溶性转铁蛋白受体(sTfR),本试验通过密码子优化提高sTfR在真核细胞中的表达水平。利用RT-PCR方法从犬肝脏中扩增sTfR编码基因,依据该基因编码的氨基酸序列,参照人偏爱的密码子,对该基因进行密码子优化并由公司合成。利用pcDNA3.1-CD5质粒分别构建野生型和密码子优化的sTfR基因真核表达载体,经磷酸钙介导使其在HEK293T细胞中进行表达,利用Western-blotting鉴定表达产物,通过ELISA检测重组犬sTfR蛋白与犬细小病毒VP2蛋白的结合活性。结果显示本试验扩增的犬sTfR基因与GenBank该基因序列的同源性为100%;通过在HEK 293T细胞中进行瞬时表达,结果显示密码子优化可以明显提高sTfR基因在HEK 293T细胞中的表达水平,提高了75%。同时表达的sTfR蛋白能够与犬细小病毒VP2蛋白进行特异结合,表明表达的重组sTfR蛋白具有天然活性。
- 潘素敏李秀锦仲飞王幸兴韩冬梅王微
- 关键词：真核表达VP2蛋白
- 犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性被引量：13
- 2009年
- 【目的】利用真核细胞分泌表达犬细小病毒VP2蛋白和研究其特性。【方法】为构建犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)VP2基因的真核分泌型表达载体,首先通过酶切从含有人CD5信号肽序列的质粒中将CD5信号肽基因片段切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp载体中CD5信号肽的下游,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经磷酸钙介导转染293T细胞,使其在真核细胞中进行分泌表达,并通过ELISA检测表达的VP2蛋白与犬转铁蛋白受体(TfR)结合的活性。【结果】序列分析结果表明,本实验构建的犬细小病毒VP2基因真核分泌型表达载体结构正确,将该表达载体转染的293T细胞,在培养基中通过Western-blot检测到有VP2重组蛋白的存在。经ELISA检测表明表达的重组VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。【结论】利用人的CD5信号肽实现了犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达,表达的VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。
- 王微李秀锦仲飞王幸兴韩冬梅靳慧君潘素敏李巍
- 关键词：犬细小病毒VP2蛋白293T细胞分泌性表达TFR
- 基于膜受体阻断犬细小病毒感染的分子机制研究
- 仲飞李秀锦仲峰李文艳王微温洁霞潘素敏潘红丽李楠王幸兴韩冬梅王利月林洪羽张永红张建楼
- 基于细小病毒VP2蛋白与宿主细胞膜TfR特异结合并介导病毒感染的特性，利用宿主细胞的TfR细胞外区（也称可溶性的TfR，即sTfR）重组蛋白封闭细小病毒颗粒，从而达到阻止细小病毒感染宿主细胞的目的。在项目研究过程中，课题...
- 关键词：
- 关键词：细小病毒感染分子生物学
- 大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基K63突变体表达载体的构建及其在真核细胞中的表达被引量：1
- 2009年
- 采用PCR方法从产肠毒素大肠杆菌（ETEC）44815菌株基因组中扩增不耐热肠毒素A亚基（LTA）编码基因，并将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因插入到含有人CD5信号肽序列的pcDNACD5sp真核表达载体中，构建成pcDNACD5sp／LTA分泌性真核表达载体，然后采用定点突变方法将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基第63位的丝氨酸改变为赖氨酸，构建成pcDNACD5sp／LTAK63突变体，经磷酸钙介导将pcDNACD5sp／LTAK63质粒转染HEK293T细胞进行表达。结果表明：试验克隆的大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因与GenBank中大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因序列相比，碱基序列、氨基酸序列同源性均达99％；表达产物经Western-blot检测，结果说明构建的含有人CD5信号肽的LTAK63基因能够在真核细胞中进行分泌性表达。
- 韩冬梅李秀锦李楠王微李巍潘素敏仲飞
- 关键词：大肠杆菌基因克隆定点突变真核表达
- 犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达被引量：4
- 2008年
- 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。
- 靳慧君仲飞吴凌娟解民王微韩冬梅
- 小鼠Flt-3L基因的分子克隆及其真核表达载体的构建
- 2008年
- 本试验通过RT-PCR的方法,从小鼠脾脏细胞总RNA中扩增出目的基因Flt-3L,并通过酶切-连接的方法将其连接到真核生物表达载体pcD-NA3.1A上,构建了重组的质粒表达载体。为了证明重组质粒上含有目的基因,用KpnⅠ和ApaⅠ酶切重组后的质粒,结果显示酶切后的片段大小与目的基因片段大小一致。经测序分析,所扩增的目的基因片段与GenBank中的基因序列完全一致,表明本试验成功地扩增了此目的基因并构建了该基因的真核表达载体。
- 周翠珍王微刘丽武杰
- 关键词：基因克隆
- 大肠杆菌LTB亚基基因表达载体对犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫应答的增强作用被引量：6
- 2011年
- 【目的】通过融合基因表达载体和共免疫基因表达载体研究大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)B亚基基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫应答的影响。【方法】提取大肠杆菌44815菌株基因组DNA,通过PCR方法从基因组DNA中扩增LTB基因,同时采用PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2的主要抗原表位基因(VP2-70,编码70个氨基酸)。将上述基因分别连接到含有人CD5信号肽序列的载体pcDNA-CD5sp上,分别构建成它们的分泌型真核表达载体,pcDNA-CD5sp-LTB和pcDNA-CD5sp-VP2-70。再利用酶切连接的方法构建LTB与VP2-70融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70。然后用pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-70组)、pcDNACD5sp-LTB-VP2-70(VP2-LTB融合组)、pcDNA-CD5sp-LTB/pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-LTB共免疫组)和pcDNA3.1A(空载体对照组)分别免疫小鼠。免疫后用间接ELISA检测不同时间小鼠血清的抗体水平,用MTT方法检测小鼠免疫5周后脾脏淋巴细胞的增殖活性。【结果】经过测序表明本研究扩增的LTB和VP2基因序列和构建的相关表达载体结构正确。通过Western-blot检测证明构建的表达载体均能介导相应基因在真核细胞进行分泌表达。ELISA检测结果表明,3组实验组小鼠接受VP2DNA疫苗免疫后均能产生特异的体液免疫应答反应,特别是VP2-LTB基因融合组小鼠的抗体水平在第5周时高达1:5120,明显高于其它两组(P<0.01)。3组免疫小鼠抗体的亚型均表现IgG1抗体水平明显高于IgG2a抗体水平(P<0.01)。淋巴细胞增殖实验结果表明,在ConA的刺激下,3组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),说明VP2DNA疫苗能够引起淋巴细胞的增殖。但3组免疫小鼠之间的刺激指数没有明显差异(P>0.05)。【结论】在小鼠体内,LTB基因表达载体可明显提高CPVVP2DNA疫苗的体液免疫应答水平。
- 韩冬梅仲飞李秀锦王微王幸兴潘素敏
- 关键词：细小病毒VP2基因DNA疫苗
