姚芳玲
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 供职机构：中南大学湘雅医学院基础医学院更多>>
- 发文基金：湖南省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- His标记STAT4(565-748氨基酸)肽段融合蛋白原核表达及纯化被引量：1
- 2018年
- 目的:构建His标记的人STAT4 C-端565-748氨基酸肽段原核表达载体,埃希氏菌中诱导表达,并纯化蛋白。方法:PCR扩增编码STAT4 C-端565-748氨基酸肽段的基因片段,克隆到pET-28a原核表达载体,转化感受态细菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,经包涵体变性、复性、树脂纯化、透析。免疫印迹鉴定纯化的融合蛋白。结果:PCR扩增获得目的片段,克隆到pET-28a,转化感受态细胞,IPTG诱导发现融合蛋白存在于包涵体。经变性、复性、树脂纯化和透析,免疫印迹实验发现融合蛋白表达、被纯化。结论:成功构建人STAT4(565-748aa)肽段原核表达质粒并获纯化融合蛋白。
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- 关键词：STAT4蛋白表达
- 检测STAT2基因多态性的PCR-PIRA方法的建立
- 2013年
- 目的:为了检测信号转导和转录活化蛋白2(signal transducer and activator of transcription factor 2,STAT2)基因的rs12422499和rs2066807两个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),建立一种简单、可靠的多聚酶链式反应-引物介导的限制性分析法(polymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis,PCR-PIRA)。方法:微量盐析法提取外周静脉全血DNA,设计引物扩增STAT2基因的rs2066807及rs12422499位点所在的基因片段,采用限制性内切酶PsyI及BseDI分别酶切相应PCR产物,凝胶电泳方法观察酶切结果。同时将PCR产物进行DNA测序。结果:PCR扩增rs2066807基因片段,长度为469bp,经PsyI酶切后电泳,根据酶切产物片段大小判断rs2066807的C/C(469 bp)、G/G(262 bp、207 bp)、C/G(469 bp、262 bp及207bp)三种基因型;PCR扩增rs12422499基因片段,长度为189 bp,经BseDI酶切后电泳,根据酶切产物片段大小判断rs12422499的C/C(189 bp)、G/G(134 bp、55 bp)、C/G(189 bp、134 bp及55 bp)三种基因型。将PCR产物直接进行DNA测序,SNP测序结果与PCR-PIRA方法获得的结果一致。结论:成功建立了一种检测STAT2基因SNPs的PCR-PIRA法,该方法只需简单的PCR扩增和酶切消化,因此操作简单、方便;通过与直接测序结果比较,显示该方法可信。PCR-RIPA方法不仅为检测STAT2基因多态性提供了实验手段,也为检测其他基因点突变提供了实验方法。
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- 关键词：单核苷酸多态性
- 人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达
- 2013年
- 目的构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达。方法设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白;采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白。结论成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达。
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- 关键词：STAT4基因克隆真核表达
