- Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备
- 2012年
- Pericardin基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogal-actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin多克隆抗体,为Pericardin功能的进一步研究奠定了基础.
- 赵碧峰唐雄卓李发祥肖丽娜杨荣江志钢吴秀山王跃群
- 关键词：果蝇原核表达多克隆抗体
- 小鼠LRRC10腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达
- 2014年
- 目的:构建含有小鼠Lrrc10(Leucine-rich Repeat Containing protein10)基因的重组腺病毒表达载体。方法:设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和SalΙ酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18T载体。测序后,用SalΙ和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM 2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果:用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论:小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。
- 周作琼彭夕洋肖丽娜李佑锋彭浩吴秀山范雄伟李永青
- 关键词：腺病毒载体心肌细胞
