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犬细小病毒VP2蛋白重组人5型腺病毒的构建被引量：1: 2013年; 目的构建犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白重组人5型腺病毒。方法将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度(TCID50)。电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平。结果重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25TCID50/ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达。结论已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒。; 杨洋宫婷米立娟赵敬慧陈奇钱方刘晔张守峰扈荣良; 关键词：VP2基因

朊蛋白,“天使”还是“魔鬼”: 2014年; 朊蛋白（PrP）是一种具有糖基化磷脂酰肌醇（GPI）的典型的膜结合型蛋白质，通过GPI与细胞膜表面糖基化位点结合，从而锚定在细胞膜表面，主要在神经元、神经小胶质细胞和脾脏中表达，称为细胞型朊蛋白（PrPC），对促进神经元和胶质细胞的发育与成熟有重要意义。但是在哺乳动物体内，一些因素能够诱发导致这种正常的糖蛋白发生空间构象转变，形成能够引起神经退行性疾病的朊病毒（Prion），即致病性朊蛋白（PrPSc），这些蛋白质分子大量聚集形成B淀粉样沉淀，聚集在中枢神经系统可引起神经元和神经小胶质细胞代谢紊乱，大量沉淀可引起神经元死亡，最后导致人和动物死亡。; 刘博浩张守峰宫婷扈荣良; 关键词：朊蛋白糖基化磷脂酰肌醇神经退行性疾病蛋白质分子天使动物体内

狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究被引量：5: 2012年; 构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性。正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性;表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100%。本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础。; 陈奇张守峰刘晔付云红孙程龙杨洋宫婷宋菲菲扈荣良; 关键词：狂犬病病毒糖蛋白杆状病毒免疫

狂犬病病毒SRV9株糖蛋白333位氨基酸变异对其免疫原性的影响: 2012年; 目的探讨狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(G)333位丝氨酸(S)分别突变为精氨酸(R)和谷氨酸(E)后,对其免疫原性的影响。方法采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异。结果 SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确;制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变;RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达;rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S(P<0.05)。结论 RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性。; 孙程龙杨洋王颖宫婷刘祥义陈奇王景龙刘晔张守峰扈荣良; 关键词：狂犬病病毒糖蛋白氨基酸免疫原性

猪瘟病毒E2蛋白基因重组人5型腺病毒的构建及鉴定被引量：3: 2012年; 目的构建猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白基因重组人5型腺病毒,并进行鉴定。方法通过巢式PCR从猪瘟活疫苗中扩增CSFV E2全基因序列,克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA的多克隆位点处,构建重组穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA-E2,将其线性化后与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,进行重组腺病毒的包装。细胞完全病变后,采用RT-PCR法检测E2基因mRNA的转录;细胞病变法检测病毒滴度;连续传代后检测病毒的稳定性;Western blot法检测E2蛋白的表达;以105.82TCID50重组腺病毒经腹腔免疫小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清猪瘟抗体效价。结果重组穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA-E2经双酶切及测序证明构建正确;重组腺病毒rAd5v-MxE2转染的293AD细胞可检测到E2基因的转录和蛋白的表达;重组腺病毒的滴度为105.82TCID50/ml;第5、30代重组腺病毒均可扩增出目的基因条带,病毒滴度无明显变化;重组腺病毒免疫小鼠后,可产生CSFV抗体。结论成功构建了CSFV E2基因重组人5型腺病毒,其免疫原性良好,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。; 杨洋高博宫婷李业伟孙程龙张守峰刘晔扈荣良; 关键词：猪瘟病毒 E2蛋白腺病毒免疫原性

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建被引量：3: 2011年; [目的]构建以pUC19质粒为基础可利用XcmI内切酶制备的T载体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUC19质粒的HindIII和BamHI位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3'末端突出一个T碱基的T载体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上。[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。; 孙程龙李业伟王颖宫婷扈荣良; 关键词：T载体 TA克隆

Construction of a pUC19-T Vector Based on Xcm Ⅰ: 2011年; [Objective] The paper aimed to construct a new T vector based on plasmid pUC19 digested with Xcm Ⅰ. [Method] Two complementary oligonucleotide chains containing two Xcm Ⅰ sites were synthesized. After denaturation and renaturation,the adaptor was cloned into plasmid pUC19 between the Hind Ⅲ and BamH Ⅰ sites. The new plasmid,pUC19-HB-T vector,was digested with Xcm Ⅰ to derive a T-vector with 3′ end overhanging a T base. [Result] The constructed pUC19-HB-T vector was efficient in cloning PCR products,with an efficiency of 95% at least. [Conclusion] A new Xcm Ⅰ-based pUC19-HB-T vector was constructed,which could be applied to cloning of PCR products and other microbiology operations.; 孙程龙李业伟王颖宫婷扈荣良

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验被引量：3: 2013年; 构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。; 宫婷张守峰刘晔孙程龙杨洋陈奇钱方刘博浩扈荣良; 关键词：猪圆环病毒2型 CAP蛋白重组腺病毒免疫原性分析

猪圆环病毒2型Cap蛋白基因重组腺病毒的构建及实验免疫研究: 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus-2, PCV-2)是迄今发现的一种最小的致病性动物病毒,是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,此外还能够引起猪的皮炎和肾病综合征(PDNS)、增生性和...; 宫婷; 关键词：猪圆环病毒2型 CAP蛋白; 文献传递

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