王东方
- 作品数：9 被引量：18H指数：3
- 供职机构：吉林农业大学动物科学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划公益性行业(农业)科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：5
- 2016年
- 为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。
- 郑光来卢晓冉张静远陈腾王东方严妍张守峰扈荣良
- 关键词：狂犬病病毒基质蛋白杆状病毒纯化多克隆抗体
- 猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
- 2016年
- 目的在毕赤酵母中分泌表达猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白。方法将PCV2-Cap蛋白基因(Gen Bank登录号:KC620508.1)按毕赤酵母偏好密码子优化后,插入毕赤酵母分泌型表达载体p PICZαA中,重组质粒p PICZαA-Cap经SacⅠ线性化,通过电击转化整合至毕赤酵母GS115菌株的基因组中,构建p PICZαA-CapGS115重组酵母菌。经甲醇诱导表达重组Cap蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-Cap经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌p PICZαA-Cap-GS115经菌落PCR鉴定,可扩增出1 001 bp的目的基因片段;表达的重组Cap蛋白相对分子质量约49 000,可与猪圆环2型阳性血清和小鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应。结论成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为PCV2亚单位疫苗和ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。
- 郑光来卢晓冉张静远陈腾王东方严妍张守峰扈荣良
- 关键词：猪圆环病毒2型CAP蛋白毕赤酵母分泌表达
- 猪肺炎支原体诱导家蝇幼虫抑制性消减文库的构建被引量：4
- 2013年
- 采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建猪肺炎支原体(Mycoplasma hyo-pneumonia,Mhp)诱导家蝇幼虫后产生差异表达基因的消减cDNA文库,并利用反向Northern杂交技术获得差异基因。结果表明,随机挑取的阳性克隆的大小均为200～750bp,通过斑点杂交技术共筛选出186个差异基因片段,对其克隆、测序及同源性分析后鉴定出20种编码蛋白的基因片段和21个无同源序列。家蝇幼虫经猪肺炎支原体诱导后产生与抗病原体相关的基因及大量的未知基因。
- 王东方张惠马红霞高云航段永杰王莹卞璐王艳芳
- 关键词：猪肺炎支原体家蝇抑制性消减杂交
- 金黄色葡萄球菌诱导的家蝇幼虫抑制性消减文库的构建
- 家蝇(Musca domestica)作为一种独特的经济昆虫,对各种恶劣的环境都具有极强的适应能力和独特的免疫防御机制,这种独有的抗病能力预示其体内存在抗病基因或是与抗病相关的差异表达基因。随着研究的深入发现,家蝇这种高...
- 左红梅张惠王东方刘树明马红霞
- 文献传递
- 小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达、纯化及其抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：7
- 2017年
- 目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)N蛋白,纯化后建立其抗体间接ELISA检测方法。方法人工合成PPRV N蛋白基因序列,并构建重组质粒pSumo-mut-N,转化至大肠埃希菌Arctic Express中,IPTG诱导表达,并对IPTG浓度和诱导时间进行优化。表达的融合蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,以其作为包被抗原建立PPRV抗体间接ELISA检测方法,对临床样本进行检测。结果重组表达质粒pSumo-mut-N经双酶切和测序证明构建正确。N蛋白最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG于11℃诱导10 h。表达的重组蛋白相对分子质量约71 900,纯化后纯度在80%以上,浓度可达120μg/ml,与PPRV阳性抗体具有良好的反应原性。基于N蛋白建立的PPRV抗体间接ELISA方法样品检测结果与已知血清之间的符合率为100%。结论原核表达并纯化了PPRV N蛋白,建立的基于N蛋白的PPRV抗体ELISA检测方法为PPRV抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用奠定了基础,对于流行病学免疫监测及控制PPRV的流行具有重要意义。
- 王东方刘晔米立娟张守峰扈荣良
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达抗体检测酶联免疫吸附测定
- 狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒中的表达及鉴定被引量：1
- 2016年
- 采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒BD06株的磷蛋白(P)基因片段,将其插入杆状病毒穿梭载体pFastBac 1获得的pFastBac 1-P重组质粒,转化E.coli DH10Bac成功构建出杆状病毒表达质粒Bacmid-P,用脂质体介导Bacmid-P转染Sf9细胞获得重组杆状病毒(AcMNPV-P)。经SDS-PAGE、Western blot和直接免疫荧光分析鉴定,BD06-P蛋白在杆状病毒中成功表达,且具有良好的反应原性,为进一步研究狂犬病病毒磷蛋白的结构和功能奠定了基础。
- 郑光来卢晓冉张永武张静远陈腾王东方严妍张守锋扈荣良
- 关键词：狂犬病病毒杆状病毒表达系统磷蛋白
- 四种病原菌诱导家蝇幼虫后构建的抑制性消减杂交文库中差异表达基因的分析
- 对分别以猪致病性大肠杆菌、猪肺炎支原体、鸡白痢沙门氏菌及牛多杀性巴氏杆菌诱导家蝇幼虫后构建的四个抑制性消减文库中筛选到的差异表达基因进行分析。结果显示,不同病原菌诱导家蝇幼虫后筛选到了大量与家蝇免疫防御、信号传导、及物质...
- 唐艳裴志花王莹张惠左红梅王东方马红霞
- 关键词：家蝇幼虫抑制性消减文库差异表达基因
- 文献传递
- 马源抗犬瘟热病毒免疫球蛋白的制备
- 2016年
- 将犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)疫苗株接种Vero细胞,连续培养至TCID50为10-4.625/m L。采用肋间肌多点注射方法免疫马,4周后每2周采集血液,分离血清,病毒中和试验测定血清中中和抗体效价,最高值达到212.5。以硫酸铵沉淀法纯化Ig G,病毒中和试验测定其中和抗体效价可达214。通过肌注犬观察,无明显不良反应。研究结果证明,本试验制备的马源免疫球蛋白可用于犬的抗体治疗,为犬瘟热的治疗制剂研发开辟了新方向。
- 严妍张锦霞王东方郑光来张守峰扈荣良
- 关键词：犬瘟热病毒纯化免疫球蛋白
- 狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及鉴定被引量：1
- 2015年
- 目的构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RABV)BD06株磷蛋白(phosphoprotein,P)的重组人5型腺病毒,并进行鉴定。方法质粒p MD18-T-BD06P经双酶切后,获得完整的P蛋白基因,将其克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒pac Ad5CMVK-Np A,构建重组穿梭质粒pac Ad5CMV-BD06P,与骨架质粒pac Ad5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化后,共转染HEK293AD细胞,经同源重组,获得表达RABV P蛋白的重组人5型腺病毒r Ad5-BP。采用K覿ber法计算r Ad5-BP滴度,RT-PCR、Western blot、直接免疫荧光方法(direct immunofluorescence assay,d FA)检测P蛋白基因在HEK-293AD细胞的转录及表达水平。以107 TCID50r Ad5-BP肌肉注射免疫昆明小鼠,14 d后,经尾静脉采血,分离血清,IFA法检测抗RABVP蛋白抗体及其反应活性。结果经酶切及测序鉴定证明重组穿梭质粒pac Ad5CMV-P构建正确;重组腺病毒r Ad5-BP滴度可达108 TCID50/ml,能够介导P蛋白在HEK293AD细胞中的转录及表达,接种小鼠后可刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性。结论成功构建了RABVBD06株P蛋白重组人5型腺病毒,该病毒能够介导P蛋白在小鼠体内有效表达,刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性,为进一步研究RABV P蛋白在病毒感染过程中的作用奠定了基础。
- 靳红亮王述超高菽蔓张守峰严妍王东方刘晔扈荣良
- 关键词：狂犬病病毒磷蛋白
