郭芬 作品数:23 被引量:33 H指数:3 供职机构: 广东药学院生命科学与生物制药学院 更多>> 发文基金: 国家教育部博士点基金 广东省自然科学基金 国家自然科学基金 更多>> 相关领域: 生物学 医药卫生 更多>>
BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用 2012年 RHOX5基因是最早发现的小鼠RHOX基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome)成员,可特异性地在生殖系统中表达。RHOX5蛋白在胚胎发育、生殖组织的发育、精子的生成和成熟等多个环节发挥作用,但其功能的发挥途径尚不明确。在前期筛选与RHOX5蛋白相互作用的分子中初步获得一个BRPF1的新型转录本BRPF2。进一步构建pGBKT7-BRPF2质粒,酵母双杂交实验确定其与RHOX5蛋白的相互作用,GST-pull down实验确定其在体外的直接结合;PCR扩增BRPF1基因,构建pGBKT7-BRPF1和pGADT7-BRPF1质粒,酵母双杂交实验和GST-pulldown实验证明RHOX5蛋白亦可以直接结合BRPF1蛋白。BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用证实暗示了BRPF2极有可能与BRPF1竞争性结合RHOX5蛋白,为三种蛋白功能的研究提供了新的思路。 郭芬 林丕容 李月琴 苏宪礼 王丁丁 周天鸿关键词:蛋白相互作用 酵母双杂交 小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达 被引量:1 2003年 目的:为制备重组小鼠Pem(以下简称mPem)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白,作为研究mPem蛋白功能的材料.方法:根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物,PCR扩增小鼠Pem基因编码序列,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中,得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem,用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白,SDS-PAGE及WesternBlot鉴定表达产物.结果:重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白.结论:成功构建了mPem-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白,为mPem蛋白功能的研究打下了基础. 张畅斌 李月琴 郭芬 王莹 周天鸿关键词:基因表达 大肠杆菌 小鼠 原核表达质粒 胚胎发育 Prosaposin基因哺乳动物细胞表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立 2010年 目的构建前凋亡因子prosaposin的哺乳动物细胞表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定转染prosaposin的细胞系。方法采用PCR方法扩增prosaposin的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc抗原表位标签,共同克隆至pcDNA3.1(+)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒。用脂质体将经过验证、测序的pcDNA-Psap-Myc质粒转染NIH3T3细胞,通过G418筛选建立稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。采用RT-PCR和western blotting方法,检测prosaposin在稳定转染的NIH3T3细胞系中的表达。结果成功构建了pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒,建立了稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达prosaposin-Myc融合蛋白。结论Prosaposin哺乳动物细胞表达质粒的成功构建和稳定转染NIH3T3细胞系的建立,为进一步体外研究prosaposin蛋白的功能及其与其他分子间的相互作用奠定了基础。 郭芬 李月琴 李实骞 罗志文 张欣 周天鸿联合靶向Survivin和Livin的双重siRNA表达载体的构建及其活性鉴定 被引量:1 2013年 目的构建联合靶向凋亡抑制基因Survivin和Livin的双重siRNA表达载体并鉴定其活性,为研究同时下调Survivin和Livin表达的协同效应奠定基础。方法选取已证实有效的分别靶向Survivin和Livin的siRNA序列,通过定向克隆技术构建同时编码2个siRNA分子的真核表达载体pSilencer2.1-Sur-Liv,将其转染HepG2细胞后检测Survivin和Livin mRNA水平的变化,同时转染表达DsRed2-SURVIVIN和GFP-LIVIN的Hela荧光报告细胞观察荧光强度变化。结果双重siRNA表达载体pSilencer2.1-Sur-Liv构建成功,转染HepG2后Survivin和Livin mRNA水平明显下降,转染Hela报告细胞后荧光强度变弱。结论联合靶向Survivin和Livin的双重siRNA表达载体构建成功,并能有效下调Survivin和Livin的表达水平。 陈孟璋 郭芬关键词:RNA干扰 SURVIVIN LIVIN 含外显子8的prosaposin蛋白亚型与Rhox5蛋白间的相互作用 被引量:1 2010年 研究含外显子8的prosaposin蛋白亚型(PsapE8)与同源异型框蛋白Rhox5蛋白间的相互作用.重叠延伸PCR法扩增PsapE8的cDNA序列,将其按照通读框方式分别克隆至pGBKT7和pGADT7酵母双杂交载体中构建pGBKT7-PsapE8和pGADT7-PsapE8重组质粒.酵母双杂交实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在酵母体内的结合;体外转录翻译S35标记的PsapE8蛋白,GSTpull-down实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在体外的结合情况.成功地构建了pGBKT7-PsapE8和pGADT7-PsapE8重组质粒,酵母双杂交实验表明PsapE8蛋白在酵母体内可以结合Rhox5蛋白;GST pull-down实验再次验证了两者在体外的结合;表明含有外显子8的prosaposin蛋白亚型PsapE8可以与Rhox5蛋白相结合. 郭芬 李月琴 李实骞 罗志文 张欣 周天鸿关键词:蛋白相互作用 小鼠Myf5真核表达载体的构建及其在细胞中的定位 2010年 目的:获得小鼠生肌调节因子Myf5基因并构建pEYFP-C1真核表达载体,观察Myf5在小鼠C3H10T1/2细胞中的定位。方法:利用PCR获得Myf5基因克隆到pEYFP-C1载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染C3H10T1/2细胞,荧光观察融合蛋白的表达。结果:从小鼠cDNA文库中得到760bp的myf5的CDS序列后,重组到pEYFP-C1载体中并转染C3H10T1/2细胞,荧光显示Myf5蛋白定位在细胞核中。结论:Myf5载体成功构建并在小鼠C3H10T1/2细胞表达,证明了Myf5蛋白定位于细胞核,为进一步研究Myf5与其他蛋白的相互作用奠定了基础。 刘向东 郭芬 黄晓峰 刘兆宇 张欣 李月琴 周天鸿关键词:MYF5 细胞定位 应用载体介导的RNAi技术抑制HCMV的UL49基因表达 被引量:2 2005年 为了研究RNA干涉抑制HCMV UL49基因的作用,以pLXSN(U6启动子)为模板通过两步PCR的方法扩增含U6启动子的siRNA表达片段,并通过TA克隆将siRNA表达片段克隆到pMD18-T载体构建成siRNA表达质粒,同时以人巨细胞病毒AD169病毒株基因组为模板PCR扩增UL49基因,将其克隆到pEGFP-N1构建融合质粒pEGFP-UL49。通过脂质体介导将siRNA表达质粒和pEGFP-UL49质粒共转染人宫颈癌细胞系HeLa,在荧光显微镜下观察RNA干涉结果。通过这种方法得到具有介导RNA干涉的siRNA片段,为UL49基因沉默研究提供技术基础。 曾志锋 李月琴 唐冬生 张欣 王莹 郭芬 周天鸿关键词:RNAI技术 RNA干涉技术 人巨细胞病毒 基因表达 载体介导 小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定 被引量:3 2009年 目的:表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法:生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。结果:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5 C 3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。结论:实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。 郭芬 李实骞 欧淑芳 初彦辉 李月琴 张欣 周天鸿关键词:原核表达和纯化 人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测 被引量:1 2010年 目的:生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法:生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果:RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论:探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。 苏宪礼 郭芬 刘兆宇 陈孟璋 张欣 周天鸿 李月琴关键词:基因 酵母双杂交 生物信息学 自激活 mPem蛋白相作用分子的筛选与鉴定 被引量:7 2006年 mPem是同源异型框基因,其C末端编码同源异型域。为进一步研究mPem蛋白在胚胎发育和生殖组织发育过程中的作用,利用GAL4酵母双杂交系统筛选小鼠7d胚胎cDNA文库,共获得3个与mPem蛋白相作用的分子。其中之一为Mdfic,一种新的转录调控因子。进一步的酵母双杂交和体外GST_Pulldown试验再次确认两者之间的相互作用。Mdfic与mPem蛋白之间的相互作用暗示两者有可能组成转录调控复合体,共同参与胚胎分化的调控,为两种蛋白功能的研究提供新的思路。 罗志文 郭芬 李月琴 李实骞 张欣 李弘剑 周天鸿