王子见
- 作品数：8 被引量：31H指数：3
- 供职机构：吉林大学人兽共患病研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家杰出青年科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 华支睾吸虫成虫cDNA表达文库的构建与筛选被引量：2
- 2009年
- 为了获得华支睾吸虫成虫期强反应原性抗原基因，首先利用λZAP载体构建华支睾吸虫成虫cDNA表达文库：即从我国东北疫区（镇赉县）家犬胆管内分离收集华支睾吸虫成虫，采用Trizol Reagent提取其总RNA，Oligo（dT）纤维素柱纯化mRNA，反转录合成第1链eDNA及第2链cDNA，用CHROMASPIN-400柱离心层析纯化后，与载体xZAPExpress连接，体外包装后成功获得我国东北疫区华支睾吸虫成虫cDNA表达文库。文库容量为1．5×10^6pfu，重组率为99％，插入片段长度在0．4～2．0kb之间，扩增文库的滴度为1．5×10^10 pfu／mL。然后利用免疫学方法对该cDNA表达文库进行筛选：以自然感染华支睾吸虫的人血清为抗体探针，从2．0×10^5个重组噬菌体筛选强反应原性抗原基因，对筛选出的强反应原性克隆进行测序，利用相关分子生物学软件进行序列分析。共获得41个阳性克隆，测序结果分析表明，这些cDNAs根据其编码的蛋白可分为以下几种，即与来自华支睾吸虫的甘氨酸-2、脯氨酸-2及Cs44抗原高同源的基因及分别与来自Nematostella vectensis的未知蛋白、转录延伸因子及果蝇CG3446基因编码蛋白较低同源性的基因。本研究结果为进一步对华支睾吸虫抗原的生物学特性研究及应用奠定了理论基础和实验依据。
- 吴秀萍高丽芳张玲邓洪宽刘相叶叶春艳王子见王学林王峰刘明远
- 关键词：华支睾吸虫成虫CDNA文库
- RNA干扰技术在动物寄生线虫研究中的局限性被引量：3
- 2008年
- RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种应用广泛的基因功能研究技术,不仅应用于模式生物秀丽隐杆线虫中,而且已成为鉴定基因功能高通量的筛选方法。但是,最近的研究发现,RNAi在动物寄生性线虫的应用上还存在一些问题,如:RNAi在不同线虫体内效果差异较大,同一种线虫不同发育时期的效果差异也较大。产生这些问题的原因可能有:①RNAi传送途径的效率在不同的寄生性线虫中是不同的;②RNAi机制只存在于相关的线虫中,大多寄生性线虫都存在着基因功能缺陷;③RNAi可能受线虫不同生活方式的影响。本文就RNA干扰技术在动物寄生性线虫研究中的局限性作一综述。
- 王子见吴秀萍邓洪宽刘明远
- 关键词：RNA干扰动物线虫
- 鼠脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅱα)基因的克隆及原核表达
- 2009年
- 根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)基因设计引物,通过RT-PCR扩增出鼠DNaseⅡα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109。经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNaseⅡα基因序列完全一致,大小为1 008 bp。将重组质粒pMD-DNaseⅡα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定。结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNaseⅡα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应。
- 王卫芳刘明远欧阳红生吴秀萍王学林刘玛峰杨勇孙磊王子见张瑞于艳玲
- 关键词：克隆原核表达
- 旋毛虫Serpin基因的体外表达及其特性鉴定被引量：7
- 2009年
- 目的体外表达旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serpin)基因,并检测其在旋毛虫不同发育时期mRNA转录、蛋白表达与分子定位及反应原性情况,为以其作为候选诊断抗原基因提供实验依据。方法根据旋毛虫Serpin基因序列,以重组质粒pBlue-script-WM5为模板,利用PCR技术去除其全长cDNA的信号肽序列,采用原核表达载体pET-28a构建不含该基因信号肽的、融合蛋白不含组氨酸标签的重组表达质粒pET-28a-WM5,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物纯化后,采用Westernblot法检测反应原性。免疫组织化学技术检测Serpin蛋白在旋毛虫不同发育时期的表达及定位情况。采用RT-PCR和实时定量RT-PCR技术检测Serpin基因在旋毛虫不同发育时期的转录水平。结果重组质粒pET-28a-WM5经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,Serpin基因能够在大肠杆菌中高效表达。重组蛋白主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的51.1%。纯化后的重组蛋白纯度可达98%,与猪抗旋毛虫60d抗血清有较好的反应原性,与26d猪抗血清无明显反应信号;RT-PCR与实时定量RT-PCR结果显示,该基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,有2个转录高峰期(Ad2/Ad3和ML)以及1个转录水平明显下降期(Ad5);免疫组化鉴定表明,Serpin天然抗原在旋毛虫肌幼虫时期18d开始表达,且在感染35d后大量表达和分泌。结论已获得较高纯度的旋毛虫Serpin体外表达融合蛋白,其具有较好的反应原性。旋毛虫Serpin基因具有期特异性表达的特点,且在肌幼虫期具有高转录与高表达水平,可作为捕获旋毛虫肌幼虫期循环抗体的候选诊断抗原基因。
- 吴秀萍于申业刘相叶王学林杨勇王子见夏慧卿邓洪宽Boireau P刘明远
- 关键词：旋毛虫
- 旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因的筛选与分析被引量：3
- 2009年
- 筛选旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因。利用λZAP载体构建旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库。用感染旋毛虫26 d猪血清对其进行免疫学筛选,对筛选出的阳性克隆进行测序与分析;应用RT-PCR方法对编码p46 000蛋白强阳性克隆基因在不同发育时期虫体转录情况进行检测。成功构建了旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库,其库容量为1.5×106pfu,重组率为95%,插入片段在400 bp^2 000 bp之间,扩增后文库滴度为1.5×1012pfu/mL。筛选出阳性克隆33个,序列分析表明,有20个克隆为同一已知基因,称为旋毛虫p46 000蛋白,编码旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂,且在筛选过程中反应信号均较强;还发现了一些旋毛虫新基因,如编码Ubc蛋白,GM13181蛋白,Rieske硫铁蛋白1等。本研究获得了一个高丰度、反应原性较强抗原基因,其编码蛋白为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
- 吴秀萍刘相叶王学林张小玲王子见唐斌陈根元杨勇刘明远
- 关键词：旋毛虫抗原基因
- 华支睾吸虫成虫和囊蚴cDNA文库表达序列标签（EST）测序及分析
- 华支睾吸虫病是华支睾吸虫寄生在人类或者其他的哺乳动物肝胆管内而引起的一种重要的人兽共患寄生虫病,不仅给人类健康造成了威胁,而且对渔业生产造成了不小的经济损失。全世界约有3,500万人口感染此病,而在中国就高达1,200万...
- 王子见
- 关键词：华支睾吸虫成虫囊蚴EST
- 文献传递
- 三种吸虫感染与胆管癌发病关系的研究进展被引量：11
- 2010年
- 由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、麝猫后睾吸虫(Opisthorchis viverrini)和猫后睾吸虫(Opisthorchis fe-lineus)所引起的吸虫病是严重危害人类健康的食源性寄生虫病,在亚洲地区流行较为广泛,人们通过食含有囊蚴的生鱼或虾类而感染。长期且重度感染会造成肝脏机能障碍,如胆结石和胆囊炎等。近年来,越来越多的研究表明这三种吸虫与胆管癌之间存在着病因学联系。本文对他们之间的关系及胆管癌可能的发病机制进行综述。
- 刘国兴吴秀萍王子见白雪刘明远
- 关键词：华支睾吸虫胆管癌发病机制
