蒲圻
- 作品数：4 被引量：11H指数：3
- 供职机构：北京协和医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人膜联蛋白V的重组表达与细胞凋亡显像被引量：3
- 2006年
- 蔡炯李方郑连芳张迎强蒲圻王世真
- 关键词：膜联蛋白V细胞凋亡细胞膜磷脂程序性细胞死亡显像磷脂酰丝氨酸
- 阿尔茨海默病患者β淀粉样肽40人单链抗体在大肠杆菌的表达和纯化被引量：3
- 2006年
- 目的:重组表达并纯化抗β淀粉样肽40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料。方法:实验于2004-08/2005-03在核医学实验室完成。自制人单链抗体基因。将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗β淀粉样肽40人单链抗体基因,克隆到pET22b(+)质粒,转化BL21-gold大肠杆菌,经0.5mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导表达抗β淀粉样肽40的人单链抗体。采用Ni2+-NTA-树脂柱亲和纯化尿素变性的包涵体内表达产物,经柱上复性,含咪唑缓冲液洗脱获得人单链抗体。应用Westernblot和酶联免疫吸附实验鉴定纯化的抗β淀粉样肽40的人单链抗体。用Branford法测定纯化抗体的浓度。结果:①抗β淀粉样肽40人单链抗体基因长度约为750bp,重组表达产物相对分子质量33000。②经过一次亲和柱纯化,从细菌包涵体中纯化出高纯度的抗β淀粉样肽40人单链抗体。③酶联免疫吸附实验分析表明纯化单链抗体和β淀粉样肽40结合的A595nm高于对照,差异显著(0.59±0.06,0.12±0.02,P<0.05),表明从包涵体中纯化出来β淀粉样肽40人单链抗体保持了结合抗原的免疫活性。纯化β淀粉样肽40人单链抗体浓度为96mg/L。结论:抗β淀粉样肽40的人单链抗体在大肠杆菌系统得以重组表达,利用亲和层析成功获得高纯度的重组单链抗体。
- 蔡炯李方王世真郑连芳蒲圻
- 关键词：阿尔茨海默病淀粉样Β蛋白基因表达
- 突变型人膜联蛋白V的重组表达被引量：6
- 2006年
- 目的 将人膜联蛋白V基因突变后转化入毕赤酵母重组表达，从培养液中纯化出具有内在金属螫合位点的活性突变型人膜联蛋白V。方法 应用特异引物将天然人膜联蛋白V基因的5’和3’端进行突变改造，将突变型膜联蛋白V基因插入到pPIC9K质粒并进行基因测序鉴定。将正确连接的表达质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115中。通过MD平板筛选转化子、BMGY培养基培养、甲醇诱导表达目的蛋白质。培养物经过离心获取上清液，用SDS-PAGE和银染分析蛋白质的表达情况，通过外露磷脂酰丝氨酸的红细胞和异硫氰酸荧光素标记膜联蛋白V测定上清液中突变型人膜联蛋白V的结合活性。结果 天然人膜联蛋白V基因5’端融合GCAGCGGCTGCGGCCAT编码序列，3’端946-948位TGT突变为AGC。毕赤酵母转化子分泌产生相对分子质量为36000的蛋白质，其半数抑制浓度为4nmol/L。结论 利用毕赤酵母系统表达出高活性的、具有内在金属螫合位点的突变型人膜联蛋白V。
- 蔡炯李方张迎强郑连芳蒲圻
- 关键词：膜联蛋白V突变毕赤酵母
