樊炜
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院野战输血研究所更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型的建立被引量：1
- 2011年
- 目的建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型，对细胞内病毒蛋白和核酸的表达水平进行定量。方法把neo抗性基因插入到Luc-JCl中，构建Luc-JC。将体外转录的Luc-JCRNA转染Huh7细胞，经筛选后获得的G418抗性克隆，通过荧光素酶活性检测、Westernblot和HCVNS3／4A对eYFP—MAVS的切割试验进行鉴定。用IFN-α处理筛选到的细胞，观察细胞中荧光素酶活性、HCV相关蛋白和RNA的变化，对复制细胞在抗病毒药物评价方面的应用进行初步验证。结果G418加压筛选得到了多个含HCV全基因组的细胞克隆。在细胞克隆中，荧光素酶活性检测观察到萤火虫荧光素酶；Westernblot检测到HCVNS3和NS5A蛋白的表达；由于NS3／4A的切割，eYFP—MAVS的定位由线粒体转移到细胞质。IFN-α处理阳性克隆细胞，荧光素酶活性、HCV蛋白表达和RNA水平明显降低。结论成功建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型，报告基因能用来指示细胞内HCV蛋白和RNA的表达水平，为进一步开展HCV致病机制研究和治疗药物筛选奠定了基础。
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- 关键词：丙型肝炎病毒萤火虫荧光素酶细胞模型
- 膜锚定Gaussia萤光素酶的细胞标记及生物荧光成像
- 2011年
- 目的:制备表达膜锚定Gaussia萤光素酶(extGluc)报告基因的慢病毒,用于标记细胞。方法:将报告基因extGluc克隆至慢病毒载体pCCsin.PPT.SFFV.IRES.eGFP.Wpre(VeGFP)中,以聚乙烯亚胺(PEI)介导,将慢病毒包装所需4种质粒(pVeGFP-extGLuc、pMDL、pRev、pVSVG),转染293FT细胞,72 h后收集病毒上清进行浓缩,感染293FT细胞,并用流式细胞仪检测病毒滴度,生物荧光成像和化学发光分析extGluc的表达;之后,用收集的慢病毒感染人单核细胞白血病细胞株U937。结果:对经PCR筛选出的阳性克隆所含质粒进行酶切鉴定,表明extGlu报告基因插入载体中;重组慢病毒包装成功且病毒滴度为5×106 TU/mL;用包装的病毒颗粒感染293FT细胞,生物荧光成像和化学发光证实extGluc的膜定位,且酶活性与细胞数目呈线性相关;病毒颗粒能够感染悬浮细胞U937。结论:包装了extGluc标记的重组慢病毒,可用于标记细胞,为体内监测细胞迁移、聚集和变化提供了一种方法。
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- 双荧光素酶标记丙型肝炎病毒亚基因组复制子细胞模型的建立被引量：2
- 2013年
- 目的构建双荧光素酶标记丙型肝炎病毒(HCV)亚基因组复制子细胞模型,为HCV研究提供有效工具。方法通过单克隆筛选及慢病毒感染构建双荧光素酶标记的HCV亚基因组复制子细胞模型(HCV Fluc-UbiGluc)。利用荧光素酶检测、Western印迹检测鉴定细胞模型,利用IFN-α对HCV抗病毒效果评价验证细胞模型的有效性。结果筛选所得HCV亚基因组细胞克隆检测到荧光素酶活性,Western印迹检测到HCV NS5A蛋白表达。NS3/4A对黄色荧光蛋白(YFP)标记的MAVS(YFP-MAVS)切割作用使亚细胞定位发生转移。IFN-α处理后荧光素酶活性、HCV蛋白表达水平明显降低。结论该模型采用萤火虫荧光素酶报告基因指示HCV亚基因组在细胞内的复制水平,Gaussia荧光素酶指示细胞的生长数量,能准确反映候选药物对HCV复制水平的影响,并有效排除药物的细胞毒性干扰,具有操作简单、快速等优点,在抗病毒药物高通量筛选、HCV致病机制等研究方面具有一定的价值。
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- 关键词：丙型肝炎病毒细胞模型复制子
- 生物素化标签真核表达载体的构建及其在蛋白检测中的应用被引量：2
- 2011年
- 目的构建生物素化标签真核表达载体,利用生物素化蛋白检测快速、灵敏、简便的特点,对传统的Western印迹和pull down技术进行改进和优化。方法利用pCI neo载体骨架构建生物素化真核表达载体。将红色荧光蛋白插入表达载体,用辣根过氧化物酶标记的链亲和素对融合蛋白进行Western印迹检测;将萤火虫荧光素酶插入表达载体,利用pull down技术定量分析生物素化效率;将丙型肝炎病毒NS4B蛋白插入表达载体,通过pulldown技术研究丙型肝炎病毒NS4B蛋白的蛋白质间相互作用。结果构建的生物素标签真核表达载体能使目的蛋白生物素化。报告基因定量分析结果表明目的蛋白生物素化效率达72%。将该载体表达的融合蛋白应用于Western印迹和pull down技术中可实现无需特异性抗体的一步法快速检测。结论将生物素化标签真核表达载体用于Western印迹和pull down技术,建立了快速、灵敏、简便的融合蛋白质检测新方法,为生命科学领域提供了一种有利的研究工具和通用技术平台。
- 彭剑淳高博贾帅争樊炜詹林盛
- 关键词：真核表达载体PULLDOWN
