藏雨轩
- 作品数：6 被引量：17H指数：3
- 供职机构：吉林医药学院检验学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金吉林省教育厅基金吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- TMEM16A钙激活氯离子通道在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的表达及其电生理特性研究被引量：6
- 2014年
- 目的:探讨跨膜蛋白16A(TMEM16A)钙激活氯离子通道在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞的表达及其电生理特性。方法:构建pUB6/V5-TMEM16A真核表达载体。脂质体方法转染TMEM16A至FRT细胞,同时优化脂质体和载体的量和比例,获得最佳转染效率和表达效果,杀稻瘟菌素(blasticidin)进行抗生素筛选,获取稳定表达TMEM16A的FRT细胞株。RT-PCR和免疫荧光检测TMEM16A于FRT细胞的表达情况;倒置荧光显微镜下观察TMEM16A在FRT细胞中的表达和定位;应用全细胞膜片钳技术和卤族元素敏感的荧光蛋白YFPH148Q/I152L检测TMEM16A钙激活氯离子通道的功能。结果:BamHⅠ和XbaⅠ双酶切的琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明目的基因TMEM16A成功克隆到真核表达载体pUB6/V5中;RT-PCR和免疫荧光实验结果表明经杀稻瘟菌素筛选后的FRT细胞在mRNA和蛋白水平表达TMEM16A,倒置显微镜下观察结果表明TMEM16A在FRT细胞膜上有表达;应用全细胞膜片钳技术和卤族元素敏感的荧光蛋白YFP-H148Q/I152L证实稳定表达于FRT细胞的TMEM16A具有经典的钙激活氯离子通道特性。结论:FRT细胞可高效表达TMEM16A。TMEM16A是钙激活氯离子通道的分子基础。
- 郝峰白雪松鞠晓红方芳藏雨轩朱杭飞向国艳张雲乔袁忠海
- 关键词：膜片钳术
- YFP-H148Q/I152L在FRT细胞中的表达及其对碘离子敏感特性的研究被引量：5
- 2015年
- 为探讨YFP-H148Q/I152L在FRT细胞中的表达及其对碘离子的敏感性,应用点突变试剂盒将真核表达载体YFP特异编码序列第148位氨基酸H突变为Q,第152位氨基酸I突变为L,脂质体介导将YFP-H148Q/I152L转染入稳定表达Ano2的FRT细胞中,应用荧光淬灭动力学试验检测YFP-H148Q/I152对其碘离子的敏感性。测序结果证实,成功将YFP突变为YFP-H148Q/I152L,且荧光淬灭动力学试验表明,表达YFP-H148Q/I152L的FRT细胞在加入激活剂和碘离子后,相对荧光强度显著下降。表明成功构建YFP-H148Q/I152L真核表达载体,并证实表达于FRT胞浆中的YFPH148Q/I152L具有对碘离子敏感的特性。
- 郑锴朱杭飞王长文郭素红李正祎藏雨轩张雲乔郑岩方芳郝峰
- 增强型绿色荧光蛋白融合对Ano1钙激活Cl-通道生理特性的影响被引量：5
- 2015年
- 本研究旨在探讨融合在Ano1钙激活Cl^-通道(anoctamin1)C末端的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对Ano1生理特性的影响。分别构建融合和未融合EGFP的Ano1真核表达载体,通过脂质体介导分别将这两类真核表达载体转染至Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞,倒置荧光显微镜下观察融合和未融合EGFP的Ano1在FRT细胞中的表达与定位;荧光淬灭动力学检测Ano1转运I^-的能力。结果显示,融合和未融合EGFP的Ano1均表达于FRT细胞膜上,且均能被Ca^(2+)激活,融合和未融合EGFP的Ano1转运I^-的能力无明显差异。以上结果提示,Ano1和EGFP-Ano1具有相似的生理特性。
- 郑锴许会静藏雨轩侯毅鞠张丽杨海鸥朱洁方芳郝峰
- 关键词：融合蛋白增强型绿色荧光蛋白生理特性
- 重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体的构建及其在FRT细胞中的表达和定位被引量：3
- 2013年
- 目的:构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-aquaporin-4,以EGFP示踪aquaporin-4在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞(FRT细胞)中的表达和定位,为进一步研究aquaporin-4提供实验依据。方法:应用RT-PCR方法获得aquaporin-4编码区基因,克隆入真核表达载体pEGFP-N1。经酶切和测序鉴定证实为aquaporin-4后,Lipofectamine 2000脂质体转染重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体至FRT细胞中,倒置荧光显微镜下观察aquaporin-4在FRT细胞中的表达和分布,并应用Western blotting法检测aquaporin-4蛋白的表达。同时检测转入FRT细胞内钙黄绿素的相对荧光强度以判断FRT细胞水通透性的状况。结果:EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切和测序重组载体结果证实目的基因aquaporin-4成功克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。荧光显微镜下观察融合EGFP的aquaporin-4主要在FRT细胞膜上表达;Western blotting结果证实脂质体转染重组载体的FRT细胞表达aquaporin-4。转染重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体的FRT细胞水通透性显著高于未转染的FRT细胞,其水通透性是未转染FRT细胞的1.65倍。结论:成功构建aquaporin-4真核表达载体,证实其可在FRT细胞中表达,并具有明显的膜蛋白特性和良好水通透性。
- 李凤娥郝峰藏雨轩马睿泽孔繁利刘磊李艳
- 关键词：AQUAPORIN-4转染
- Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础
- 2014年
- 目的探讨Ano2是否为钙激活氯离子通道的分子基础。方法用RT-PCR技术扩增Ano2编码基因,将Ano2连接到真核表达载体p EGFP-N3;通过脂质体介导将Ano2转染至FRT细胞,抗生素筛选获得稳定表达Ano2的细胞系;倒置荧光显微镜下观察Ano2在FRT细胞中的表达和分布,Western blot检测Ano2的表达;全细胞膜片钳技术研究Ano2的电生理学特性。结果成功构建p EGFP-Ano2真核表达载体;Ano2表达在FRT细胞膜上;Ano2电流呈Ca2+、时间和电压依赖性,电流和电压关系呈外向整流。结论 Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础。
- 藏雨轩方芳朱杭飞向国艳张雲乔李瑷彤郝峰
- 关键词：转染
- 限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切条件的优化被引量：2
- 2014年
- 目的探讨KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。方法 KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切体系,酶切含有上述两种限制性内切酶酶切位点的载体pEGFP-Ano2,DNA琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,以获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的优化条件。结果 50μL酶切体系,KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切的适宜条件:首先在1×L缓冲液情况下,应用1μL KpnⅠ酶切1μg质粒1 h,再加入1×H缓冲液和0.01%BSA,应用1μL EcoRⅠ继续酶切1 h。结论获取KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒的适宜条件,为今后应用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切实验提供科学的参考依据。
- 朱杭飞姜晓明藏雨轩张雲乔向国艳张中新郝峰
- 关键词：双酶切DNA琼脂糖凝胶电泳
