娄高杰
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
- 供职机构：西安交通大学医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Nogo66-siRNA和hNGFβ双基因共表达腺相关病毒骨架质粒的构建与鉴定
- 背景介绍:脊髓损伤是一种常见而且严重的临床疾患。脊髓组织作为成熟的中枢神经系统,神经元已失去分裂和再生新神经元的能力,但成熟神经元具有再生轴突的能力。近年来,包括神经生长因子(NGF)和神经轴突再生抑制因子(Nogo)在...
- 李若飞党晓谦李建伟王坤正柏传毅包理中娄高杰
- 关键词：腺相关病毒双基因共表达
- 文献传递
- 双基因共表达腺相关病毒穿梭质粒的构建与鉴定
- 2009年
- 目的合成和筛选nog066-siRNA干扰片段，克隆神经生长因子-β（NGF-β），构建含nog066-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒。方法设计针对nog066的siRNA，插入载体pGenesil-1．1，转染大鼠胶质瘤C6细胞，通过RT-PCR和Western-blot检测筛选有效的干扰质粒；培养人MIApaca-2细胞，提取总RNA，进行RT-PCR得到人NGF-β基因，插入T-easy载体；将pGenesil-1．1与pAAV-MCS进行重组，得到含u6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV—U6／CMV—EGFP；将nog066一siRNA和NGF-β分别插入pAAV-U6／CMV-EGFP中，构建含nog066-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒。结果干扰质粒pGenesil-nogo66-siRNA测序显示十扰序列正确；RT-PCR结果显示转染后各条带相对亮度有差异，转染pGenesil-nog066-siRNA-1和pGenesil-nog066-siRNA-2使nogo基因表达降低；Western-blot结果显示转染pGenesil-nogo66-siRNA、1使NOGO蛋白表达下降73％，转染pGenesil-nog066-siRNA-2使NOGO蛋白表达下降78％，与未转染组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）；质粒T-easy-NGF-β酶切可见3000bp、736bp条带，测序显示基因序列正确；酶切pAAV-U6／CMV-EGFP、pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-EGFP町见4300bp、800bp条带．转染细胞后均可见绿色荧光蛋白表达；酶切pAAV-U6／CMV-NGF-β、pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-NGF-β可见4300bp、736bp条带；质粒pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建了含有nog066-siRNA与NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿格质粒，为深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础。
- 李若飞李建伟党晓谦王坤正柏传毅包理中娄高杰
- 关键词：神经生长因子基因表达腺相关病毒
- 髓磷脂相关抑制物66小分子干扰真核表达载体构建与筛选
- 2010年
- 目的构建并筛选出具有干扰作用的髓磷脂相关抑制物66(neurite outgrowth inhibitory 66,nogo66)小分子干扰RNA(samll interfering RNA,siRNA)真核表达载体,为进一步构建腺相关病毒载体奠定基础。方法设计2条针对大鼠nogo66基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和1条阴性对照序列,插入载体pGenesil-1.1,同时用pGenesil-1.1质粒作为空白对照,得到4种质粒pGenesil-nogo66-siRNA-1、pGenesil-nogo66-siRNA-2、pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb,对4种质粒进行DNA测序和酶切鉴定;培养大鼠胶质细胞瘤C6细胞,用4种质粒进行转染,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白,检测转染效率;采用RT-PCR和Western blot分别检测nogo基因在mRNA水平和蛋白水平的表达差异,筛选出对nogo66基因具有干扰作用的nogo66-siRNA表达质粒。结果DNA测序显示设计的2种质粒干扰序列正确;KpnⅠ/XhoⅠ双酶切4种质粒均可见800bp及4.3kb条带;4种质粒分别转染C6细胞后培养48h,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达,平均转染效率约为73%。RT-PCR和Western blot检测显示:与未转染细胞相比,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使nogo基因表达下降22%、蛋白表达下降73%,转染pGenesil-no-go66-siRNA-2使nogo基因表达下降28%、蛋白表达下降78%,差异均有统计学意义(P<0.05);而转染pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb后nogo基因表达和蛋白表达均无明显下降(P>0.05)。结论成功构建并筛选出具有干扰作用的nogo66-siRNA真核表达载体,为深入研究脊髓损伤修复奠定了理论基础。
- 李若飞党晓谦李建伟王坤正柏传毅包理忠娄高杰
- 关键词：真核表达脊髓损伤
