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Maxadilan 对兔角膜上皮细胞的促增殖作用: 2011年; 目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的PAC1受体特异激动剂Maxadilan对角膜上皮细胞的促增殖作用。方法分离新西兰大白兔角膜上皮细胞,并在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔角膜上皮细胞PACAP的PAC1受体;细胞增殖实验采用CCK-8法检测,角膜上皮细胞培养基中分别加入0.01μmol.L-1、0.03μmol.L-1、0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan作为实验组,未加入Maxadilan作为对照组,检测不同浓度的Maxadilan对角膜上皮细胞增殖的影响;流式细胞仪分析0.10μmol.L-1Maxadilan对细胞周期的影响。结果 RT-PCR检测显示兔角膜上皮细胞含有PACAP的PAC1受体;CCK-8法检测显示0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan实验组分别比对照组细胞增多29.1%、41.5%、32.5%,与对照组相比差异有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000);流式细胞仪分析显示0.10欁μmol.L-1Maxadilan组细胞增殖指数平均值为35.98%,与对照组细胞细胞增殖指数平均值29.48%相比,差异有统计学意义(P=0.014)。结论角膜上皮细胞存在PACAP的PAC1受体,Maxadilan对角膜上皮细胞有促增殖作用。; 招志毅陈建苏余榕捷谭美华李红阳李红阳刘晓飞; 关键词：MAXADILAN 角膜上皮细胞细胞增殖

重组血管活性肠肽的制备及鉴定: 2009年; 为利用基因工程技术获得重组血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP),根据大肠杆菌的密码偏好性,设计并人工合成编码28个氨基酸的VIP的cDNA。克隆到表达载体PTWIN,构建重组质粒PTWIN-VIP,转化宿主菌E.coli Strain ER2566,构建表达工程菌。实现由重组VIP,内含肽与纤维素结合域(cellulose binding domain,CBD)组成的融合蛋白表达。融合蛋白经几丁质亲和层析纯化,通过改变温度和缓冲液PH值切割融合蛋白,获得目的多肽。所得的多肽经质谱测定分子量结果与理论值相符。生物活性分析表明,重组VIP能显著降低急性炎症小鼠血清中抵抗素的水平,发挥抗炎作用。重组VIP的制备及其抗炎活性的鉴定为其深入开发奠定了基础。; 谢珊珊余榕捷曾乐李娟王静静洪岸; 关键词：血管活性肠肽内含肽抗炎作用

重组PTD-maxadilan的制备与鉴定被引量：3: 2009年; 为了构建能够有效进入血脑屏障的新型融合蛋白PTD-maxadilan(PTD-MAX),设计编码融合蛋白PTD-MAX基因,克隆到表达载体pKYB,构建重组表达载体pKYB-PTD-MAX,转化大肠杆菌ER2566中。采用IPTG诱导由PTD-MAX、内含肽和几丁质组成的融合蛋白的表达。利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)介导的纯化系统制备目的融合蛋白PTD-MAX。所得的目的蛋白经激光飞行质谱测定分子量,结果与理论值相符。动物实验结果表明融合蛋白PTD-MAX能够有效穿越血脑屏障,重组PTD-MAX具有比天然maxadilan更显著(P<0.05)的抑制小鼠摄食的作用。融合蛋白PTD-MAX的构建和制备为其生物学功能的深入开发奠定了基础。; 曾乐余榕捷徐明芳陈建苏王静静李娟; 关键词：MAXADILAN 内含肽血脑屏障

带有穿膜肽重组PTD-KLF4的制备及活性鉴定: 2011年; KLF4是Kruppel样转录因子(kruppel-like factors,KLF)家族中的一员,是维持胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)全能性的重要转录因子。蛋白质转导结构域(protein transd uctiondomain,PTD)能够携带大分子进入细胞。为了获得具有穿膜功能的重组KLF4蛋白,利用原核表达载体PKYB表达KLF4与PTD的融合蛋白PTD-KLF4,用Ni柱纯化融合蛋白并作Westernblotting鉴定。利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记PTD-KLF4检测其穿越中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测重组融合蛋白PTD-KLF4结合目的DNA的活性。结果表明:重组PTD-KLF4可以成功进入细胞、定位细胞核内,穿膜效率为(22.29±2.1)%。重组融合蛋白PTD-KLF4引起细胞形态变化,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。重组PTD-KLF4的制备为外源蛋白诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,IPSCs)奠定基础。; 苏航余榕捷刘晓飞王静静李晓霞陈建苏; 关键词：KLF4 荧光共振能量转移

带有穿膜肽重组PTD-Sox2的制备及活性鉴定: 2011年; 目的:制备带有穿膜肽的重组蛋白PTD-Sox2并对其活性进行鉴定。方法:通过将Sox2基因与穿膜肽基因PTD融合,利用原核表达载体pKYB进行表达,用Ni柱制备、纯化融合蛋白;用Western blot对其进行鉴定;用FITC标记PTD-Sox2,与CHO细胞孵育,检测其穿膜能力;用FRET法检测转录因子Sox2结合目的DNA的活性。结果:构建了带有穿膜肽重组PTD-Sox2的原核表达菌,制备并纯化PTD-Sox2,对其活性鉴定。结论:PTD-Sox2能够穿过细胞膜与核膜,进入细胞核内,穿膜效率为40.86%,并且可与目的DNA进行特异结合,为蛋白体外诱导iPS的产生奠定基础。; 刘晓飞余榕捷王静静苏航黄霖陈建苏; 关键词：核转录因子 FITC FRET

带有穿膜肽PTD的重组Oct4的制备及活性鉴定被引量：3: 2011年; 目的:重组蛋白构建细胞转录因子PTD-Oct4。方法:利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒pKYB-PTD-Oct4,并转染至E.coli ER2566。镍柱纯化重组蛋白并用Western bloting对其进行鉴定。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记PTD-Oct4,检测其穿透中国仓鼠卵巢(CHO)细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(FRET)检测重组融合蛋白PTD-Oct4结合目的DNA的活性。结果:成功获得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功进入细胞,定位于细胞核内,穿膜效率为(28.3±2.4)%,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。结论:制备重组PTD-Oct4为外源蛋白诱导多能干细胞(IPSCs)奠定基础。; 李红阳李晓霞余榕捷刘晓飞王静静苏航陈建苏; 关键词：OCT4

重组PAC1-EC1(N)对表达不同PAC1变体的细胞系细胞活性的影响: 2011年; 垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)特异受体PAC1(normal型)N端胞外域[简称PAC1-EC1(N)]具有调控PAC1活性的作用。为研究PAC1-EC1(N)对表达不同PAC1变体的细胞系活性的影响,利用基因工程技术获得C端带有6个his纯化标签的重组PAC1-EC1(N)。质谱检测、SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果均显示成功表达和纯化目的蛋白PAC1-EC1(N)。Western blot检测确定兔眼角膜基质细胞、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人前列腺癌细胞22RV1中分别表达一个或多个分子量不同的PAC1变体。重组PAC1-EC1(N)作用3株细胞,MTT方法检测细胞活性,结果显示:PAC1-EC1(N)有效促进只表达一个小分子PAC1变体的兔眼角膜基质细胞的增殖;但显著抑制只表达一个大分子PAC1变体的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的活性。对于表达3种大小不一的PAC1变体的人前列腺癌细胞22RV1,PAC1-EC1(N)对细胞的活性具有复杂的调控。显示PAC1-EC1(N)对表达PAC1变体数量不同,类型不同的细胞具有不同的生物活性的作用,提示了PAC1变体可能具有较复杂的自我调控机制。; 李娟余榕捷王静静黄霖刘晓飞; 关键词：生物活性

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王静静