林陈水
- 作品数：50 被引量：102H指数：6
- 供职机构：浙江工业大学药学院更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金浙江省科技厅资助项目江西省教育厅青年科学基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生轻工技术与工程更多>>
- SELEX技术中制备单链DNA的方法
- 2024年
- 制备单链DNA(ssDNA)是许多常用实验中的重要内容,是通过指数富集的配体系统(SELEX)进行体外筛选核酸适配体的关键步骤之一。目前已报道多种方式可通过双链DNA(dsDNA)制备ssDNA,包括链霉亲和素包被磁珠分离、不对称PCR、不等大小引物PCR、酶消化、不对称PCR结合酶消化和不对称乳液PCR等,而如何快速高效地制备ssDNA是研究重点。本文综述了常用的几种通过聚合酶链式反应(PCR)制备ssDNA的方法,对其进行综合分析。根据产物的纯度、操作难易、实验成本等方面综合考虑,选择产物高纯度、操作简便且实验成本较低的ssDNA制备方法,为具有不同需求的应用场景提供参考依据。
- 徐婷钰林陈水
- 关键词：核酸适配体聚合酶链式反应
- 有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示被引量：3
- 2010年
- PCR扩增来自黄杆菌ATCC27551的有机磷水解酶基因opd,直接与XcmⅠ酶切去除Ampr基因片段的pZXL-T连接,将opd克隆于锚定单元Lpp-OmpA编码序列下游,转化E.coliBL21(DE3).经抗性筛选、PCR鉴定和测序证实,成功构建了具有全细胞催化效应的大肠杆菌细胞表面展示工程菌.SDS-PAGE结果表明,工程菌能表达产生51 kD的融合蛋白.细胞表面展示的有机磷水解酶具有较高全细胞酶活性,用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低90%.
- 黎小军林陈水胡军民
- 关键词：细胞表面展示T载体大肠杆菌
- 基于响应面分析方法的有机磷水解酶全细胞活性表达条件的优化
- 2010年
- 为了提高有机磷水解酶(OPH)全细胞活性,对其表达条件进行了优化。首先采用Plackett-Burman试验设计对8个影响因素进行筛选,结果表明,诱导时间、IPTG浓度和诱导温度3个因素对OPH全细胞活性影响较大。在此基础上采用Box-Behnken设计,利用Design Expert软件进行二次回归分析,得到该基因工程菌的最佳表达条件为诱导温度18.86℃,IPTG浓度0.09mmol/L,诱导时间8.74h。OPH全细胞活性的最大预测值为27.829U/mL,试验验证值为27.8U/mL。
- 黎小军胡军民林陈水
- 关键词：有机磷水解酶PLACKETT-BURMAN设计BOX-BEHNKEN设计响应面法
- 分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌的构建被引量：6
- 2014年
- 水蛭素(Hirudin,HV)是目前已知的最强有力的凝血酶天然抑制剂,对多种血栓性疾病有很好的预防和治疗作用.构建两种融合DsbA信号肽的分泌型水蛭素Ⅱ基因工程菌,一种分泌的是N端第一个氨基酸突变为Ala的突变型水蛭素Ⅱ(spHV2mut),而另一种分泌的是天然型水蛭素Ⅱ(spHV2).采用重叠延伸(SOE)技术对水蛭素ⅡN端第一个氨基酸的基因序列进行定点突变,分别将突变和未突变的水蛭素Ⅱ基因重组至DsbA信号肽的编码基因下游,经限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ酶切后,重组于表达载体pET-39b(+),转化至E.coli BL21(DE3),获得两种工程菌.分别经IPTG诱导表达和周质蛋白提取,再经阴离子交换层析纯化,得到两种重组水蛭素.通过凝血酶滴定法进行活性测定,比活性相同,突变型的表达量提高了近一倍,天然型水蛭素Ⅱ(spHV2)为500ATU/mL,突变型水蛭素Ⅱ(spHV2mut)为900ATU/mL.
- 林陈水陈微微
- 关键词：水蛭素分泌表达突变体活性测定
- 一种保健红曲糯米酒及其制备方法
- 本发明提供了一种保健红曲糯米酒及其制备方法，所述保健红曲糯米酒由以下重量份的原料制成：糯米100‑120份、中药组合配料6‑12份、红曲20‑25份、聚赖氨酸0.05‑1份和水120‑150份，所述中药组合配料由以下重量...
- 闫晓玉黄洁金志敏周良普林陈水
- 一种周质分泌融合表达型前T载体及其制备与应用
- 本发明提供了一种周质分泌融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI－GSGSG－HHHHHH－XcmI－Amp<Sup>r</Sup>－XcmI－HindIII的DNA1片段；(2)定点突变pET3...
- 林陈水于真真杨丹燕许明任慧颖
- 文献传递
- Burkholderia cepacia XYU-6脂肪酶的克隆及其细胞表面展示被引量：2
- 2015年
- 通过分析Gen Bank中Burkholderia cepacia脂肪酶的序列,设计简并引物,采用同源克隆的策略,成功地从B.cepacia XYU-6菌株中克隆到脂肪酶基因bcl,其大小为1 095 bp,编码364个氨基酸(Gen Bank登陆号KR233260).将bcl基因与质粒p ET-28b(+)连接并转化大肠杆菌,使脂肪酶BCL的大肠杆菌胞内过表达,其活力是野生菌的12.9倍.通过将bcl基因克隆到细胞表面展示载体p ZXL中,构建脂肪酶BCL的细胞表面展示工程菌,使BCL在Lpp-Omp A引导下定位于大肠杆菌细胞表面,其活力是野生菌的3.9倍.研究结果为脂肪酶BCL后续的分子改造和应用奠定基础.
- 黎小军林陈水
- 关键词：脂肪酶克隆细胞表面展示
- HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中的表达被引量：2
- 2009年
- 分泌融合表达HIV-1蛋白酶(Protease,PR),用于对HIV蛋白酶抑制剂的筛选.利用重叠延伸PCR方法,获得使用大肠杆菌偏爱密码子的编码HIV-1蛋白酶(PR)的基因,将目的基因重组至原核表达载体pET-SP-DsbA-T,得到"pET-SP-DsbA-PRsite-PR"分泌融合表达型载体,重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3).工程菌在LB培养基中添加终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析周质蛋白.DNA测序结果证实合成的HIV-1 PR基因与设计的序列完全一致,在周质空间表达出具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.研究成功合成并克隆了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,经表达鉴定得到具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.
- 靳传涛林陈水
- 关键词：HIV-1蛋白酶分泌表达
- 亮氨酸脱氢酶研究进展及其工业应用被引量：4
- 2012年
- 微生物脱氢酶催化羰基不对称还原制备光学纯氨基酸及其衍生物具有非常大的优势。亮氨酸脱氢酶能选择性地催化α-酮酸,氨化还原得到α-氨基酸及其衍生物。本文综述了亮氨酸脱氢酶的来源,理化性质,底物特异性,酶基因工程菌构建等方面的内容及研究进展。从辅酶再生策略,酶膜反应器两方面讨论了其工业化应用,并展望了今后的发展前景。
- 黄春辉林陈水
- 关键词：辅酶再生酶膜反应器
- 天冬氨酸酶E.coli融合表达研究被引量：4
- 2012年
- 以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。
- 任慧颖黎小军杨丹燕林陈水
- 关键词：天冬氨酸酶融合蛋白DSBA
