国家自然科学基金(81170066)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
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- 野生型大鼠Rab5a基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT的转化扩增及鉴定
- 2013年
- 目的对含野生型大鼠Rab5a基因载体pcDNA3-Rab5(a)WT进行体外转化、扩增及鉴定,为基于Rab5a的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-Rab5(a)WT质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养后抽提质粒,用超微量核酸蛋白测定仪测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-Rab5(a)WT质粒均为浓度高、纯度高、超螺旋结构为主的质粒。pcDNA3-Rab5(a)WT经PCR后得到Rab5a基因。结论成功转化并扩增了pcDNA3-Rab5(a)WT,为Rab5的相关研究提供了高质量的表达载体。
- 孙欢杨俊俊贺斌峰王关嵩
- 关键词：RAB5A质粒转化
- DAPK1在急性肺损伤小鼠肺组织中的表达及其作用被引量：2
- 2017年
- 目的探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)在急性肺损伤小鼠肺组织中的表达及在炎症失控中的作用。方法将30只雄性C57小鼠按随机数字表法分为5组:正常对照组、LPS诱导急性肺损伤3、6、12、24 h组。应用2 mg/kg DAPK1抑制剂TC-DAPK 6预处理小鼠后,再用10 mg/kg LPS诱导小鼠肺损伤。HE染色光镜观察小鼠肺组织病理改变;免疫组化检测肺组织中DAPK1的表达和分布;应用RT-PCR和Western blot检测肺组织DAPK1和NF-κB p65的表达;ELISA检测血清炎症因子TNF-α、IL-6水平变化;Kaplan-Meier生存分析对各组小鼠存活时间进行分析。结果 LPS致伤组肺组织可见明显病理损伤改变且随时间进展加重,而DAPK1蛋白在正常对照组小鼠肺组织仅少量表达,在急性肺损伤小鼠肺组织中表达随时间进展明显增加;与正常对照组相比,LPS组肺组织DAPK1 mRNA蛋白表达水平均明显增高(P<0.05),血浆炎症因子TNF-α、IL-6均明显升高(P<0.05)。抑制小鼠肺DAPK1表达可明显降低LPS诱导的肺组织中DAPK1和NF-κB p65蛋白水平、血清炎症因子TNF-α、IL-6的水平(P<0.05)。此外,抑制DAPK1可延长LPS致急性肺损伤小鼠的生存期(P<0.01)。结论 DAPK1通过调控NF-κB炎症通路参与了LPS诱导的小鼠急性肺损伤,其可作为潜在的治疗靶点。
- 刘霞郭小莉雷传江王关嵩王建春
- 关键词：急性肺损伤核因子ΚB
- 脂多糖诱导巨噬细胞中核受体协同抑制因子启动子甲基化对炎症因子的调控作用被引量：2
- 2017年
- 目的探讨核受体协同抑制因子(NCOR)在脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症反应中的作用及其调控机制。方法 1μg/ml的LPS分别处理小鼠巨噬细胞RAW264.7 24 h和48 h,应用Western blot和Real time-PCR检测NCOR的表达水平以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)mRNA水平,荧光素酶报告基因检测核因子-κB(NF-κB)的启动子活性。LPS处理细胞48 h后,应用MSP检测NCOR启动子是否发生甲基化以及Western blot检测DNMT3b的表达变化。Real time-PCR检测5'-aza和LPS联合处理细胞后NCOR mRNA的表达水平;转染DNMT3b siRNA后,分别应用Western blot和Real time-PCR检测DNMT3b的表达水平,以及DNMT3b siRNA和LPS联合作用下NCOR、TNF-α、IL-6的表达水平和NF-κB的启动子活性。结果 LPS干预细胞24、48 h后,NCOR蛋白和mRNA表达显著下调(P<0.05),而TNF-α、IL-6 mRNA表达水平、DNMT3b蛋白的表达水平以及NF-κB的启动子活性显著上升(P<0.05)。MSP检测说明LPS可介导NCOR的启动子甲基化。用5'-aza和LPS联合处理细胞后NCOR mRNA水平较LPS组有显著上升(P<0.05)。采用DNMT3b siRNA可显著下调DNMT3b蛋白和mRNA水平,并可部分逆转LPS介导的抑制NCOR表达的效应,抑制TNF-α、IL-6的表达水平和NF-κB的启动子活性(P<0.05)。结论 NCOR启动子的甲基化是LPS介导巨噬细胞炎症反应发生、发展的关键步骤,其可作为治疗ALI/ARDS的潜在靶点。
- 郭小莉刘霞雷传江王关嵩王建春
- 关键词：DNA甲基化核转录因子ΚB炎症因子
- Rab1对海水干预肺微血管内皮细胞β肾上腺素受体表达的调节作用被引量：1
- 2012年
- 目的研究Rab1对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)β肾上腺素受体(β-ARs)表达的调节作用。方法取原代培养的RPMVECs作为研究对象,设计3个实验:(1)检测海水干预对β-ARs表达的影响,设对照组和海水处理(SW)组。(2)构建大鼠野生型Rab1慢病毒表达载体(Rab1WT)和Rab1阴性突变体慢病毒表达载体(Rab1N124I),检测两种质粒转染对β-ARs及其亚型(β1-AR、β2-AR)表达的影响,设对照组、转染Rab1WT组(WT组)和转染Rab1N124I组(N124I组)。(3)检测Rab1WT转染对海水处理β-ARs表达的影响,设对照组、SW组和转染Rab1WT后海水处理组(WT/SW组)。上述3个实验中,对照组RPMVECs常规培养至实验结束;SW组细胞常规培养后用海水处理2h;WT组和N124I组细胞分别转染Rab1WT和Rab1N124I(滴度109TU/ml);WT/SW组细胞转染Rab1WT后培养48h,用海水处理2h。β-ARs及其亚型的表达均采用配体饱和测定法进行检测。结果 (1)对照组和SW组RPMVECs表面β-ARs的表达量分别为2107.00±202.36和1324.00±130.01cpm/105细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)对照组、WT组和N124I组β-ARs的表达量分别为2048.00±207.64、2833.00±203.07和1040.00±91.59cpm/105细胞(P<0.05),β1-AR分别为517.78±29.65、591.22±18.29、364.11±20.68cpm/105细胞(P<0.05),β2-AR分别为1627.90±112.27、2262.10±169.33和694.33±29.79cpm/105细胞(P<0.05)。与对照组比较,WT组β1-AR的表达增加了14.2%(P<0.05),β2-AR增加了49.0%(P<0.01)。(3)SW组β-ARs的表达量为1276.00±121.42cpm/105细胞,与对照组(2059.00±174.62cpm/105细胞)比较下降了38.0%(P<0.01),WT/SW组β-ARs的表达量为2017.20±101.14cpm/105细胞,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与SW组比较增加了58%(P<0.01)。结论海水干预可降低β-ARs在RPMVECs细胞膜上的表达,Rab1可对抗该作用,使β-ARs的表达上调。
- 李运成王关嵩魏征华吴国明钱桂生
- 关键词：GTP结合蛋白质类血管内皮细胞
