国家教育部博士点基金(2004-165)
- 作品数：1 被引量：2H指数：1
- 相关作者：伊正君颜玉蓉邱宗荫付玉荣更多>>
- 相关机构：重庆医科大学潍坊医学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定被引量：2
- 2007年
- 背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用。本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a(+)中。进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性。结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a(+)载体中,经酶切与测序鉴定完全正确。此重组质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr70000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%。经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%。结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达;蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡。
- 付玉荣伊正君颜玉蓉邱宗荫
- 关键词：SMMC-7721细胞凋亡诱导因子蛋白质纯化
