黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521371)
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- Wistar大鼠热休克蛋白70基因重组腺病毒质粒的构建及病毒制备
- 2012年
- 目的构建Wistar大鼠热休克蛋白(Heat shock protein 70,HSP70)基因重组腺病毒质粒,并制备重组腺病毒。方法利用RT-PCR技术从Wistar大鼠脾脏组织中扩增HSP70基因序列,并克隆至pMD18-T载体中,测序鉴定后,将克隆的HSP70基因编码阅读框亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中,并利用Ⅰ-CeuⅠ与Ⅰ-SceⅠ将重组穿梭质粒上的HSP70基因的表达框切下,连接到携带腺病毒骨架载体pAdxsi上。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后,转染至293(R)细胞进行病毒的包装,获得重组腺病毒pAd-CMV-HSP70,收集病毒上清,感染BRL细胞,Western blot检测BRL细胞中HSP70的表达。病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,检测重组腺病毒纯度、颗粒滴度及感染性滴度。结果克隆质粒、穿梭质粒经PCR及酶切鉴定,均可见2 269 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank登录的序列一致;XhoⅠ酶切结果显示,HSP70基因已正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒感染BRL细胞后,细胞中HSP70的表达量显著升高(P<0.01);重组腺病毒纯化后纯度为1.29,颗粒滴度为5.31×1012VP/ml,感染性滴度达1×1011pfu/ml。结论已成功构建Wistar大鼠HSP70基因重组腺病毒质粒,并制备出高滴度的重组腺病毒颗粒,为进一步研究HSP70的生物学活性及作用机制奠定了基础。
- 郭景茹臧琳郭爽王建发计红李士泽薛琳琳杨焕民
- 关键词：HSP70基因重组腺病毒基因表达
