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国家自然科学基金(31301668)

作品数：7 被引量：4H指数：1
相关作者：赵静肖留斌谭永安郝德君孙洋更多>>
相关机构：江苏省农业科学院南京林业大学扬州大学更多>>
发文基金：国家自然科学基金江苏省农业科学院科研基金国家现代农业产业技术体系建设项目更多>>
相关领域：生物学农业科学更多>>

文献类型

  • 7篇中文期刊文章

领域

  • 4篇生物学
  • 3篇农业科学

主题

  • 6篇绿盲蝽
  • 6篇盲蝽
  • 3篇抗体
  • 3篇抗体制备
  • 3篇克隆
  • 3篇基因
  • 3篇表达谱
  • 2篇单克隆
  • 2篇单克隆抗体
  • 2篇原核表达
  • 2篇蜕皮
  • 2篇蜕皮激素
  • 2篇基因克隆
  • 1篇单克隆抗体制...
  • 1篇蛋白
  • 1篇蛋白纯化
  • 1篇蛋白基因
  • 1篇多克隆
  • 1篇多克隆抗体
  • 1篇多克隆抗体制...

机构

  • 6篇江苏省农业科...
  • 4篇南京林业大学
  • 1篇扬州大学

作者

  • 6篇肖留斌
  • 6篇赵静
  • 5篇谭永安
  • 4篇郝德君
  • 3篇柏立新
  • 3篇孙洋
  • 1篇戈林泉

传媒

  • 3篇中国农业科学
  • 3篇昆虫学报
  • 1篇Insect...

年份

  • 1篇2023
  • 3篇2021
  • 3篇2017
共 7 条 记 录，以下是 1-7
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排序方式：
Phospholipase C gamma(PLCγ)regulates soluble trehalase in the 20E-induced fecundity of Apolygus lucorum被引量：1
2021年
Apolygus lucorum is the dominant pathogenic insect attacking Bacillus thuringiensis(Bt)cotton in China.Additionally,20-hydroxyecdysone(20E)has important functions in many biological processes,including insect reproduction.Phospholipase C(PLC),which is an essential enzyme for phosphoinositide metabolism,is involved in 20E signal transduction,but its function in 20E-mediated reproduction in A.lucorum remains unclear.In this study,20E increased A/PLCγ transcription as well as the abundance and activity of the encoded protein during molting and metamorphosis.The 20E treatment also induced the considerable accumulation of two second messengers,inositol triphosphate and diacylglycerol.The expression levels of genes encoding vitellogenin(AlVg)and soluble trehalase(AlTre-1)were similar to those of AlPLCy,and were upregulated in response to 20C.The silencing of AlPLCγ resulted in downregulated expression o f AITre-γ smdAlVg.However,the silencing of AlTre-1 and AlVg did not affect AlPLCγ expression.Moreover,the silencing of AlVg did not alter AlTre-1 expression.Furthermore,an examination of the insect specimens indicated that AlPLCy is required for female adult reproduction,and that downregulated expression of this gene is associated with decreases in fecundity,adult longevity,and egg hatching rate as well as delayed oocyte maturation.We propose that 20E regulates AlTre-1 expression via AlPLCy and affects Vg expression as well as ovary development to facilitate the reproductive activities of A.lucorum females.
Yong-An TanXu-Dong ZhaoHou-Jun SunJing ZhaoLiu-Bin XiaoDe-Jun HaoYi-Pin Jiang
关键词：REPRODUCTION20-HYDROXYECDYSONEVITELLOGENIN
绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析
2017年
【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。
谭永安赵旭东肖留斌孙洋赵静柏立新郝德君
关键词：绿盲蝽基因克隆表达谱原核表达单克隆抗体
绿盲蝽表皮蛋白基因AlCP17的克隆、多克隆抗体制备及表达谱分析被引量：1
2023年
【目的】本研究旨在通过克隆绿盲蝽Apolygus lucorum表皮蛋白(cuticular protein,CP)基因AlCP17、制备其多克隆抗体和分析其时空表达特性,为AlCP17蛋白功能的研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽表皮发育过程中的信号通路图谱提供依据。【方法】基于前期转录组数据克隆绿盲蝽AlCP17的cDNA全长序列并进行生物信息学分析;构建AlCP17原核表达载体pCZN1-AlCP17并转化大肠杆菌Escherichia coli进行体外表达,利用纯化后的重组蛋白制备AlCP17蛋白多克隆抗体;qRT-PCR检测AlCP17在绿盲蝽不同发育阶段(1-5龄若虫和成虫)和3龄初期若虫不同组织(头、胸、足、中肠、脂肪体和表皮)中的表达谱。【结果】克隆获得绿盲蝽AlCP17全长cDNA序列(GenBank登录号:OM302231),其开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸,预测蛋白分子量为21.69 kD,理论等电点为6.11。编码的蛋白质具有典型的表皮蛋白结构特征,含有节肢动物表皮蛋白几丁质保守结合域(non-cysCBD),即Chitin_bind_4结构域;氨基酸序列比结果对显示,AlCP17与半翅目(Hemiptera)臭虫科(Cimicidae)温带臭虫Cimex lectularius的CPA2B-like的氨基酸序列一致性最高(76.29%);系统发育进化树显示,CP是一种高度保守的蛋白,与温带臭虫的CPA2B-like和茶翅蝽Halyomorpha halys的CP7-like相似性高。IPTG诱导获得原核表达重组蛋白AlCP17,经纯化后制备的AlCP17多克隆抗体纯化效果较好,可以用于后续实验。AlCP17在绿盲蝽不同发育阶段和3龄初期若虫不同组织中均有表达,在初孵1龄若虫中表达量达到峰值,且在若虫各龄期的末期表达量显著上升;在3龄初期若虫中肠中表达量最高。【结论】克隆了绿盲蝽AlCP17基因cDNA全长序列,AlCP17具有昆虫表皮蛋白的典型特征,AlCP17在绿盲蝽体内的表达具有发育阶段特异性和组织特异性。这些结果为今后研究这一蛋白在绿盲蝽表皮发育过程中的生理功能奠定了基础。
谭永安张杰钰姜义平赵静肖留斌戈林泉
关键词：绿盲蝽表皮蛋白RACE多克隆抗体
绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答被引量：1
2021年
【目的】克隆绿盲蝽(Apolygus lucorum)雷帕霉素靶标全长基因(AlTOR),研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素(20E)诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础。【方法】RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot评价该抗体的特异性。【结果】AlTOR的开放阅读框编码包含435个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域;AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达。经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带。进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究。【结论】AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后,AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。
谭永安赵旭东姜义平赵静肖留斌郝德君
关键词：绿盲蝽蜕皮激素
绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答被引量：1
2017年
【目的】获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(A1EcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的�
谭永安肖留斌郝德君赵静孙洋柏立新
关键词：绿盲蝽20-羟基蜕皮酮单克隆抗体表达量
绿盲蝽磷脂酶C(AlPLC)的表达、纯化及酶学性质
2017年
【目的】本文在前期获得绿盲蝽Apolygus lucorum磷脂酶C基因(Al PLC)的基础上,明晰Al PLC基因在绿盲蝽不同日龄若虫中的表达特征,阐明Al PLC重组蛋白的酶学性质。【方法】qRTPCR法分析1-13日龄绿盲蝽若虫Al PLC的表达量;构建含有Al PLC基因的原核表达载体p Czn1-Al PLC;进一步将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白纯化,获得具有磷脂酶活性的重组蛋白;以pNPPC(P-硝基苯基磷酸胆碱)为底物测定不同温度和不同p H下的重组Al PLC蛋白酶活性,最终确定了其酶活性的最佳p H和最适温度。【结果】Al PLC mRNA在绿盲蝽测定的若虫期持续表达,在4,8,12以及13日龄若虫中表达量相对较高。重组蛋白Al PLC可在大肠杆菌Escherichia coli中表达一个约79 k D的蛋白,12%SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体形式存在;经过变性,复性获得具有磷脂酶活性的纯化蛋白。在蛋白浓度为0.25 mg/m L条件下,该酶最适温度为57℃(179.54±3.96 nmol/μg·min),最适p H为8.5(374.99±2.84 nmol/μg·min)。【结论】结果表明Al PLC在绿盲蝽若虫中表达具有特异的发育历期特性,获得的重组蛋白在较高温度和碱性环境下有较高磷脂酶活性。本研究结果为后续在蛋白水平上解析Al PLC的功能奠定基础。
谭永安赵旭东郝德君肖留斌肖留斌柏立新赵静孙洋
关键词：绿盲蝽磷脂酶C原核表达蛋白纯化酶学特性
绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因(AlGRK2)的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能
2021年
【目的】克隆绿盲蝽(Apolygus lucorum)G蛋白偶联受体激酶2基因(AlGRK2)cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素(20E)对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数(发育历期、若虫体重及成虫羽化率)的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2715 bp,开放阅读框2106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区(RGS,54—175 aa)、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(S-TKc,191—454 aa)、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分(S-TK-X,455—534 aa)和PH结构域(PH,558—655 aa),其中PH结构域是GRK2蛋白的典型结构域;系统发育分析结果表明,绿盲蝽GRK2与茶翅蝽GRK2亲缘关系最近;AlGRK2在绿盲蝽1—16日龄虫体内均有表达,mRNA表达量呈现出波动式下降的模式,在绿盲蝽初始龄期的表达量较高,而在末龄期的表达量显著下降;AlGRK2在绿盲蝽雌成虫卵巢和脂肪体中高表达,在胸与足中的表达量较低;外源20E处理后,AlGRK2在绿盲蝽1日龄和3日龄表达量显著下调,AlGRK2在雌成虫各组织中均表达上调,在卵巢及脂肪体中上调幅度最大,相反的是,20E信号通路中PLC抑制剂U73122处理的AlGRK2表达量下调;绿盲蝽若虫发育历期、末龄若虫体重和成虫羽化率均显著下降,相反的是,U73122处理组若虫期的发育历期显著延长;此外,与注射dsGFP处理组相比,注射dsAlGRK2处理后绿盲蝽的AlGRK2表达水平显著下降,若虫死亡率及发育历期显著增加,而成虫羽化率和5龄若虫体重均显著下降。【结论】AlGRK2在绿盲
谭永安姜义平赵静肖留斌
关键词：绿盲蝽蜕皮激素基因克隆表达谱RNA干扰
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