国家自然科学基金(30800534)
- 作品数：7 被引量：29H指数：4
- 相关作者：彭惠民张政何晓燕徐晓明陈涛更多>>
- 相关机构：重庆医科大学第三军医大学重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- miRNA-451表达质粒的构建及其对iNOS基因表达的抑制被引量：1
- 2009年
- 目的:探讨miRNA-451对肾小球系膜细胞中诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达的影响。方法:依据miRBase数据库中mmu-miR-451序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建pGenesil-1-miRNA-451质粒及阴性对照质粒pGenesil-1-control。将pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control质粒分别转染小鼠肾小球系膜细胞,经G418筛选,建立稳定表达pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测iNOS基因表达的差异。结果:经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的小鼠肾小球系膜细胞和稳定表达pGenesil-1-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-1-miRNA-451的小鼠肾小球系膜细胞中,细胞增殖受到抑制,iNOS基因的蛋白表达明显受到抑制,而iNOS基因的mRNA水平无明显变化。结论:miRNA-451在翻译水平抑制了iNOS基因的表达,并对小鼠肾小球系膜细胞生长具有显著的抑制作用。
- 李春蕾何晓燕彭琼乐张政武卫华彭惠民
- 关键词：INOS基因肾小球系膜细胞基因表达
- 糖尿病肾病相关微小RNA对高糖下肾小球系膜细胞增殖的影响及其机制被引量：5
- 2010年
- 目的探讨在高糖培养条件下,糖尿病肾病相关微小RNA(MicroRNA,miRNA)即miR-21对小鼠肾小球系膜细胞生长、增殖的影响,及miR-21高表达对PTEN/PI3K信号途径的影响。方法采用高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞模拟糖尿病状态,在Lipofectamine2000介导下经miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21转染,G418筛选获得稳定表达细胞株。采用实时RT-PCR检测转染细胞miR-21的表达水平,MTT法检测细胞增殖,细胞免疫化学法和Western blot法检测PTEN/PI3K信号途径关键分子PTEN、phospho-Ak(tSer473)和PI3Kp85α蛋白的表达水平。结果筛选出的肾小球系膜细胞能稳定高表达miR-21;高表达的miR-21对细胞增殖能力有明显的抑制作用,且可显著下调PTEN的表达水平(P<0.05),同时上调phospho-Akt(Ser473)和PI3Kp85α的表达水平(P<0.05)。结论 miR-21可通过特异性靶向抑制PTEN蛋白的表达,提高phospho-Akt(Ser473)和PI3Kp85α蛋白的表达水平,以减缓肾小球系膜细胞增殖,可能为一个预防和治疗糖尿病肾病新型的潜在靶点。
- 张政彭惠民徐晓明陈涛何晓燕
- 关键词：糖尿病肾病微RNASPTENPI3K
- 早期糖尿病肾病相关微小RNA在小鼠肾脏的表达变化被引量：7
- 2010年
- 目的建立db/db小鼠早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达谱。方法采用12只9周龄高血糖且24h尿白蛋白显著增高的db/db小鼠作为早期糖尿病肾病组,12只9周龄db/m小鼠作为正常对照组,用于miRNA芯片和实时荧光定量RT-PCR检测。Trizol法抽提肾脏总RNA,YM-100微离心滤器富集小RNA,芯片技术检测DN组和对照组miRNAs的差异表达谱。应用实时荧光定量RT-PCR验证部分差异miRNAs,运用生物信息学技术预测部分相关miRNAs的靶基因。结果芯片结果显示,66个miRNA在DN组和对照组存在差异表达(P<0.01),其中35个miRNAs在DN组呈高表达,31个miRNAs在DN组呈低表达,差异倍数从1.08～10.20。实时荧光定量RT-PCR进一步验证部分miRNA的表达,结果显示3个miRNAs在DN组表达上调,分别为:miR-196a、miR-98和miR-29c;4个表达在DN组下调,分别为miR-21、miR-451、miR-709和miR-187,差异显著(P<0.01)。结论部分miRNAs在DN和正常对照肾脏组织中存在差异表达,可能参与了DN发生的分子机制。
- 张政罗勇军彭惠民何晓燕
- 关键词：糖尿病肾病MICRORNA
- 小鼠微RNA miR-21真核表达质粒的构建及其在小鼠肾小球系膜细胞中的表达被引量：2
- 2010年
- 目的构建小鼠微RNA miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中表达。方法人工合成小鼠miR-21基因序列,构建miR-21真核表达质粒pGenesil-miR-21。使用脂质体Lipofectamine2000转染小鼠肾小球系膜细胞后,G418筛选,获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR技术检测miR-21的表达。结果经酶切鉴定和测序证实,合成的miR-21基因序列完全正确,并已成功克隆到真核表达质粒pGenesil-1上。重组真核表达质粒转染小鼠肾小球系膜细胞后,筛选出的阳性克隆可稳定高表达miR-21。结论已成功构建miR-21真核表达质粒,并在小鼠肾小球系膜细胞中高效表达,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了基础。
- 张政彭惠民徐晓明何晓燕
- 关键词：微RNAMIR-21真核细胞肾小球系膜细胞
- miR-21对早期糖尿病肾病db／db小鼠蛋白尿的影响被引量：3
- 2010年
- 目的了解miR-21对早期糖尿病肾病db／db小鼠24h尿白蛋白、肾小球形态学及其分子机制的影响。方法24只5周龄雄性小鼠分为4组：6只db／m小鼠作为对照组，18只5周龄高血糖且无蛋白尿的db／db小鼠分别随机分为pGenesil—miR-21质粒处理组、对照空质粒处理组及未处理组，每天尾静脉液压法注射质粒30mg·kg^-1·d^-1，直至未处理组db／db小鼠尿白蛋白排泄（UAE）显著高于db／m小鼠组。在光学显微镜下观察肾小球形态大小，计算机计算肾小球面积，实时RT—PCR检测肾脏组织miR-21的表达水平，Western印迹、免疫组化PTEN、p-Akt（Ser473）和P13Kp85d肾脏组织的蛋白质表达水平。结果5周龄db／db小鼠连续注射质粒4周后，未处理组db／db小鼠出现高血糖伴UAE显著增高，提示9周龄db／db小鼠进入早期糖尿病肾病阶段。实时RT-PCR结果显示，在注射pGenesil—miR-21重组质粒的db／db小鼠肾脏组织中，miR-21的表达显著增高（P〈0．01）。光镜观察和肾小球面积测量实验发现，pGenesil-miR-21重组质粒组肾小球显著减小。Western印迹和免疫细胞化学结果显示，miR-21处理组的db／db小鼠肾脏组织中PTEN蛋白较注射对照空质粒和未注射质粒的db／db小鼠组显著降低，而P13K p85α和磷酸化Akt（Ser473）蛋白显著增高（均P〈0．01）。结论miR-21通过特异性靶向调控PTEN／P13K信号传导途径，以抑制肾小球肥大，可能是一个新的糖尿病肾病的保护因子。
- 张政彭惠民陈涛徐晓明何晓燕晏宁
- 关键词：糖尿病肾病微RNAPTEN磷脂酰肌醇3激酶
- miRNA-451表达质粒的构建及对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响被引量：8
- 2012年
- 目的:探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法:Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真核表达载体(pGenesil-1.1-miRNA-451质粒)。将pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control质粒分别转染人A549肺癌细胞,经过G418的筛选,建立pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control稳定表达的细胞株。流式细胞术分析检测细胞凋亡的情况;Transwell小室检测miRNA-451对细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果:经测序证实miRNA-451真核表达质粒构建成功,与未处理的人A549肺癌细胞和稳定表达pGenesil-1.1-control的细胞相比,稳定表达了pGenesil-1-miRNA-451的人A549肺癌细胞的侵袭和迁移能力均明显受到抑制影响,而细胞凋亡无明显变化(P>0.05)。结论:miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移具有显著的抑制作用,但对细胞凋亡作用不明显。
- 姚莉孙艳查何彭惠民
- 关键词：肺癌凋亡
- Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达被引量：4
- 2009年
- 目的:探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法:运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果:NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低(P<0.01),为对照组(共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组)的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低(P<0.01),而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化(P>0.05).结论:肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.
- 何晓燕陈俊霞褚颖豪张政彭惠民
- 关键词：微RNA肺癌基因表达
