国家自然科学基金(30470082)
- 作品数：5 被引量：6H指数：2
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- 噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证被引量：2
- 2006年
- 目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证。方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白。然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性。最后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性。结果通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLS表达量占菌体总量的30%。同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos。经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6-TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化。结论成功地获得了具有内切酶活性的H6-TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础。
- 申晓冬胡福泉李明胡晓梅周莹冰张克斌
- 关键词：基因表达
- 末端酶介导的双链DNA病毒核酸组装
- 2006年
- 病毒是一类非细胞结构的微生物,专性宿主细胞内寄生,以复制方式进行增殖。在病毒复制的过程中,组装是其特有的过程。不同类型病毒之组装的机制有很大差异,目前对双链DNA(dsDNA)病毒的组装机制研究较多,包括位点特异性组装和满头组装两种方式,采用何种方式进行组装与其基因组编码的末端酶有关。该文介绍末端酶介导的dsDNA病毒组装的有关进展。
- 陈志瑾申晓冬张克斌饶贤才
- 关键词：双链DNA病毒
- 噬菌体DNA的衣壳化及注入宿主细胞的机制被引量：2
- 2006年
- 噬菌体能够对复制产生的DNA进行精确包装,并使基因组DNA在蛋白质衣壳内以非常稳定的形式存在。同时,噬菌体还能高效释放基因组核酸并将其注入宿主菌体内。这种奇特的生物学现象及其内在机制在各种生物物理技术的帮助下,被人类逐渐认识。冷冻电子显微镜和荧光显微镜的出现,使得从单个噬菌体颗粒水平来了解基因组DNA的释放和穿入过程成为可能。
- 申晓冬胡福泉
- 推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测被引量：2
- 2009年
- 目的检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力。方法通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109后,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后发现目的蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白。利用PCR与酶切方法获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3′端进行生物素标记。最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力。结果成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中。经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合。结论成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础。
- 申晓冬张克斌李明胡晓梅周莹冰陈志瑾胡福泉
- 关键词：EMSA蛋白表达
- 铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位DNA结合能力的测定被引量：2
- 2006年
- 目的检测铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位与噬菌体基因组末端cos位点的结合能力。方法通过PCR扩增出末端酶大亚单位编码基因tls,经pMD-T18载体克隆至表达载体pQE31上,IPTG诱导表达,获得包涵体蛋白,用包涵体裂解液溶解包涵体,通过Ni-NTA亲和层析,分离出重组目的蛋白rTLS,透析复性后,与生物素标记的基因组末端cos片段进行结合反应,通过EMSA检测DNA滞后现象。结果成功构建了表达载体pQE-tls,获得了纯化的具有生物学活性的重组末端酶大亚单位rTLS,EMSA结果证实结合rTLS后的cos片段与无蛋白加入的对照组相比明显滞后。结论重组噬菌体PaP3末端酶大亚单位在体外可与基因组末端cos片段发生特异性结合,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
- 申晓冬张克斌李明周莹冰蹇锐胡晓梅陈志瑾饶贤才胡福泉
- 关键词：EMSA蛋白表达
