国家自然科学基金(30070799)
- 作品数：8 被引量：50H指数：3
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- 相关机构：第四军医大学军事医学科学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嗅鞘细胞的培养纯化及形态学特征被引量：32
- 2002年
- 目的 建立体外培养纯化嗅鞘细胞 (Olfactoryensheathingcells,OECs)的模型 ,观察OECs生长状态和形态学变化 ,为研究神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 以原代培养的方法分离、培养成年大鼠嗅球OECs,再用阿糖胞苷抑制 ,P75抗体吸附方法纯化及Forskolin和牛垂体提取液 (bovinepituitaryextract,BPE)营养物质综合作用。根据P75免疫组化学染色结果统计所得OECs的纯度 ,同时对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 (1)此纯化方法所得的OECs纯度可达 95 %以上 ,细胞增殖速度较快 ,且细胞纯度不因培养时间的延长而明显下降。 (2 )未纯化前细胞形态多变 ,主要为巨噬细胞状、双极和多极状 ;纯化后 2～ 4天 ,OECs多呈双极或多极状 ;突起短小 ;4天后 ,OECs以突起细长的双极和三极为主 ,细胞走向一致 ,呈平行排列。结论 P75抗体吸附方法纯化效率高 ,Forskolin和BPE能够促进细胞的增殖 。
- 杨浩游思维王春婷鞠躬
- 关键词：形态学嗅鞘细胞神经损伤神经再生细胞移植
- 逆转录病毒介导的人NT-3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测被引量：3
- 2003年
- 本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素(Dox)诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT-3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果:(1)hNT-3-pcDNA的多克隆位点,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3 cDNA,定向连接到pRev-TRF上,pRev-TRF全长为6.5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。(2)hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。(3)与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组,只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT-3修饰的实验组短(P<0.01)。这些结果表明,Tet-On调控NT-3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。
- 杨浩金卫林王春婷游思维鞠躬
- 关键词：逆转录病毒介导嗅神经鞘细胞活性检测神经营养素-3
- 嗅成鞘细胞条件培养基对PC12细胞促分化作用及对分化后细胞损伤的保护作用被引量：4
- 2006年
- 目的研究嗅成鞘细胞条件培养基(OECCM)对PC12细胞促分化作用及其对-OH自由基损伤分化后细胞的保护作用。方法采用原代分离培养的方法培养和纯化嗅成鞘细胞,收集其培养上清作为OECCM,然后用其培养PC12细胞,培养3 d后,进行细胞形态学观察及-βtubulin免疫细胞化学染色,同时在同一批细胞中加入100μmol/L FeSO4和50μmol/L H2O2作用20 min,再用OECCM继续培养48 h,然后进行MTT对细胞活性进行检测和存活细胞计数。结果用OECCM培养的PC12细胞长有突起,形态酷似神经元,并且-βtubulin免疫细胞化学染色呈阳性,而对照组细胞在同样培养时间里,没有明显的形态变化,-βtubulin染色呈阴性。用FeSO4和H2O2产生的-OH自由基对分化后的PC12细胞进行损伤,发现继续用OECCM培养后,反映细胞活性的A值为0.346 5±0.032,对照组0.201 8±0.034(P<0.01);同时两组细胞存活数目的百分比分别为:实验组为(56.7±5.9)%,对照组为(23.8±7.4)%(P<0.01)。结论嗅成鞘细胞可以分泌有促PC12细胞分化作用的分子和对分化后的细胞在损伤时有保护作用的分子。
- 杨浩王春婷许汉鹏李静雯游思维鞠躬
- 关键词：嗅成鞘细胞细胞分化PC12细胞
- 嗅鞘细胞生物学特性及其在脊髓再生中应用的研究被引量：1
- 2002年
- 近年来研究证明嗅球及嗅神经组织可以分离出嗅神经鞘细胞 (olfactory ensheathingcells,OECs) ,OECs具有中枢神经系统 (CNS)星形胶质细胞和外周雪旺式细胞的特性 ,移植后的 OCEs能够在宿主损伤的脊髓组织进行迁移 ,能够引导支持损伤的神经元突起再生、生长、延伸。而且还可以通过转基因技术使其携带某些促进神经元再生的外源性基因 ,表达一些促神经再生的分子 ,从而改善神经损伤的内环境 ,诱导损伤的脊髓神经元再生 ,使得受损脊髓再生的潜力得以发挥 ,达到脊髓再生和功能恢复的目的。本文就
- 杨浩梁哲游思维鞠躬
- 关键词：嗅鞘细胞生物学特性脊髓再生细胞移植脊髓损伤基因治疗
- 逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响被引量：5
- 2003年
- 目的 研究含有睫状神经营养因子 (CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞 (OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响。 方法 通过基因克隆 ,用KpnⅠ +XbaⅠ将pcDNA3 S(NGF信号肽 ) hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下 ,插入逆转录病毒表达载体pRev TRE中。酶切鉴定后 ,将其与本系统的调控质粒pRev Tet On转入Ecopack 2 93细胞进行病毒包装 ,制备重组缺陷型hCNTF和Tet On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导 ,以Western blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测。将转染hCNTF的OECs与新生 2d大鼠DRG联合培养 ,用其上清培养视网膜节细胞 (RGCs)。经 β tubulin免疫组织化学染色后 ,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目。 结果 1 经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定 ,pRev TRE S hCNTF重组体分别被切下 6 30bp和 4 0 0bp片段 ,插入子的方向和完整性经确认与预期相符。 2 以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs ,其培养上清均有分子量约 2 4kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达 ,此表达与强力霉素的浓度呈正相关。未诱导组和对照组未见明显蛋白带。 3 同单纯OECs(2 3 15± 4 7)、空载 (2 4 5 5± 5 8)、空白 (16 8± 6 5 )等对照组相比 ,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著?
- 杨浩金卫林范明游思维鞠躬
- 关键词：逆转录病毒介导CNTF嗅神经鞘细胞神经细胞突起生长背根神经节
- 图像分析与人工计数视网膜神经节细胞方法的比较被引量：3
- 2003年
- 目的 探讨图像分析仪计数视网膜神经节细胞 (retinal ganglion cell,RGC)的特点和实际应用的可能性。 方法 自眶内切断 18只成年大鼠左眼视神经 ,近侧断端留置浸有 5 %荧光金的明胶海绵。分别于手术后 2、7、14 d处死动物 ,每一时间点各 6只。取左眼视网膜经后固定平铺于载玻片上 ,荧光显微镜下分别以人工视网膜分区取样估测法和 Quantimet5 70图像分析仪计数荧光金逆行标记的 RGC。 结果 RGC数目随手术后存活时间延长而下降 ,手术后 2、7、14 d图像分析仪和人工计数法计数的 RGC总数分别为 (12 0 6 6 3± 90 89)、(5 92 85± 170 71)、(1780 2± 1984 )个 / mm2 和 (1182 37± 7898)、(5 76 4 8±14 5 33)、(180 70± 14 6 1)个 / mm2 ,同一时间点两组间计数结果差异无显著性的意义 (P>0 .0 5 )。 结论 图像分析仪计数 RGC具有较为简便、客观和可重复计数的特点 ,可用于计数 RGC的实验研究。
- 焦西英侯冰武明媚鞠躬游思维
- 关键词：人工计数视网膜神经节细胞RGC神经元视神经细胞计数
- 兔背根神经节植块法的雪旺氏细胞培养被引量：1
- 2002年
- 目的:建立一种新的培养雪旺氏细胞(Schwann cell,SC)的方法,为神经移植研究获取高纯度的细胞奠定基础。方法:采用植块培养的方法,分离新生1～2天兔子的背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG),弃膜,剪碎进行植块的雪旺氏细胞的培养,然后采用阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)抑制,差速贴壁法、Forskolin的牛垂体提取液(bovine pituitary extract,BPE)刺激进行细胞纯化,最后S-100免疫组织化学染色进行纯度鉴定。结果:本实验采用背根神经节植块及纯化的方法获得雪旺氏细胞的纯度可达95％以上。结论:这种选用DRG组织块培养及纯化SC的方法效率很高而且简单方便,所获SC的纯度高数量大。
- 杨浩游思维王春婷吴玉梅李静雯鞠躬
- 关键词：雪旺氏细胞背根神经节细胞培养
- 稳定表达人CNTF诱导PC12细胞分化作用的研究被引量：3
- 2003年
- 目的:探讨CNTF对PC12细胞的诱导分化作用。方法:应用转基因技术将pcDNA-S-hCNTF质粒转入COS7细胞进行表达,并对CNTF表达进行检测,然后将hCNTF修饰过的COS7细胞与PC12细胞进行联合培养,4天后对CNTF作用后的PC12进行形态学观察,β-tubulin免疫细胞化学染色及不同培养时间4天,5天后阳性细胞的指数进行分析,同时通过MTF实验对诱导培养后的PC12细胞内增殖进行检测。结果:PC12细胞与hCHTF修饰过的COS7细胞经过4天的联合培养,细胞大部分形态呈现出类似于神经元的形态,胞体立体感较强,并且细胞长出较长的突起。另外细胞呈现β-tubulin反应阳性,并且随培养时间延长,β-tubulin阳性细胞的数目有增加的趋势(从76.6％增加到88.3％),最后,反映细胞增殖程度的OD值为0.328±0.019,明显低于对照组0.586±0.028,0.597±0.032。结论:hCNTF对PC12细胞向神经元分化有明显的促进作用。
- 杨浩王春婷于玲李静文游思维鞠躬
- 关键词：睫状神经营养因子PCI2细胞形态学观察
