国家自然科学基金(30500019)
- 作品数：28 被引量：70H指数：5
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- 相关机构：四川农业大学西北农林科技大学西南民族大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金长江学者和创新团队发展计划四川省教育厅资助科研项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生理学更多>>
- PPV VP2和PCV2 ORF2重组病毒样颗粒的获得及其免疫原性研究被引量：1
- 2010年
- 将PCV2 ORF2基因插入PPV VP2基因HindⅢ酶切位点(即PPV VLPs的N端1/3处)获得重组基因VP2.ORF2,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-C1中得到重组质粒pEGFP-VP2.ORF2,经转染及电镜观察表明成功获得VP2.ORF2重组病毒样颗粒。重组病毒样颗粒经超速离心纯化后免疫小鼠,同时设立PPV普通疫苗、PCV2弱毒株及空白对照组,并在不同时期检测小鼠CD_3^+、CD_4^+、CD_8^+T淋巴细胞动态变化情况及PPV和PCV2抗体水平。结果显示:VP2.ORF2重组病毒样颗粒免疫小鼠后能诱导较高水平的细胞免疫和高于同等条件普通疫苗和弱毒株的体液免疫水平。此研究结果为进一步探索VP2.ORF2重组病毒样颗粒的形成机制提供了依据,也为PPV-PCV2二联疫苗的研发打下了基础。
- 徐志文蒋清蓉郭万柱朱玲胡秋炅陈扬廖晓丹
- 关键词：猪细小病毒
- PPVSC-1株VP2基因的定点突变及真核表达载体的构建
- 2008年
- 以PPV VP2为基础,利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并将突变体克隆入pMD19-T Simple载体中;经酶切、PCR和测序鉴定后,利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建突变体与报告基因EGFP融合表达的pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)真核表达载体;利用脂质体法将重组质粒分别转染COS-7细胞。结果:成功构建了突变体的真核表达载体;在转染后的荧光观察中发现,pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)质粒转染细胞后,两者表达后的荧光信号不同,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品的荧光信号均匀分布于细胞中。提示,突变是引起表达差异的主要原因。
- 胡秋炅徐志文郭万柱朱玲王印王小玉
- 关键词：猪细小病毒VP2定点突变
- 含EGFP基因的PRV Fa株重组PPV VP2基因与PCV2 ORF2基因表达载体的构建
- 将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,得到了转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2 ORF2基...
- 陈杨徐志文郭万柱朱玲陈弟诗王印王小玉
- 关键词：VP2基因ORF2基因EGFP
- 文献传递
- ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响被引量：10
- 2008年
- 设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD。序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%~100%。用NcoⅠ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序。用SacⅡ酶切pTS-PCV2-CD-C,回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C。PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCV1阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒。试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因。
- 杨晓农郭万柱徐志文王新殷华平王小玉龙虎
- 关键词：ORF3基因基因功能
- 猪圆环病毒ORF2基因的插入对猪细小病毒VP2基因蛋白表达的影响被引量：4
- 2008年
- 将扩增得到的PCV2SC株ORF2基因插入PPVSC-1株VP2基因的HindⅢ(522bp处)和SacⅠ(1220bp处)2个特异限制酶切位点,并将此重组基因分别连接到含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒转移载体(pPI-2.EG-FP),脂质体转染系统转染COS-7细胞,倒置荧光显微镜观察重组基因表达情况。结合测序结果预测重组基因所编码的蛋白质的二级结构。
- 蒋清蓉徐志文郭万柱朱玲胡秋炅王印王小玉
- 关键词：猪细小病毒猪圆环病毒病毒样颗粒
- PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果
- 2010年
- 采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。
- 唐玉香徐志文郭万柱朱玲徐凯陈燕凌阳爱国史小红
- 关键词：猪细小病毒真核表达质粒免疫效果
- 猪IL2基因重组对PPV VP2-PCV2 ORF2真核质粒免疫原性增强的研究被引量：1
- 2011年
- 将猪IL2成熟肽基因、PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原多肽基因定向克隆至真核表达载体pCI-neo,构建重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2-ORF2-VP2,用脂质体介导法将其转染PK15细胞,采用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测重组质粒在体外的表达情况。并以小鼠为动物模型,分别将pCI-IL2-ORF2-VP2质粒、pCI-ORF2-VP2质粒、pCI空载体、猪细小灭活苗和圆环亚单位苗通过肌注进行免疫,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体效价。结果表明,重组质粒在体外能正常表达,pCI-IL2-ORF2-VP2免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和血清PPV/PCV2抗体的OD值在二免后均高于或显著高于pCI-ORF2-VP2对照组。结果表明,猪IL2基因重组能显著增强VP2/ORF2核酸疫苗诱导的免疫应答。
- 魏浩澈徐志文徐凯郭万柱朱玲唐玉香陈燕凌
- 关键词：圆环病毒2型VP2基因ORF2基因
- 猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3′端对病毒样颗粒形成的影响被引量：3
- 2009年
- 以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3′端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析。结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒。通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3′端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3′端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒。
- 徐志文郭万柱蒋清蓉朱玲熊丁杰王印徐凯王小玉
- 关键词：猪细小病毒VP2基因插入位点病毒样颗粒
- 影响伪狂犬病病毒同义密码子用法特点的因素分析被引量：4
- 2007年
- 为了充分了解伪狂犬病病毒基因组结构和病毒进化机制,计算伪狂犬病病毒各基因(组)Nc值、RSCU值、GC3s含量和双核苷酸组成,分析伪狂犬病病毒密码子用法特点.采用目前最普遍使用的多变量统计分析方法(对应分析)分析影响伪狂犬病病毒基因组同义密码子用法偏爱性的因素.结果表明:①在GC含量丰富的伪狂犬病病毒基因组中,所有基因都偏爱于以G或C结尾的密码子;②伪狂犬病病毒对CpG、CpC、GpC和GpG 4种双核苷酸具有显著偏爱性,而较少使用ApA、ApT、TpA和TpT 4种双核苷酸;③碱基组成限制、碱基突变压力、翻译选择和基因功能是形成伪狂犬病病毒密码子用法特点的4种因素.伪狂犬病病毒所有基因Nc-GC3s分布图显示有些基因如LLT ORF1、LLT ORF2等的偏向性完全是由于碱基的组成限制.GC3s-GC12s散点图则显示碱基突变和自然选择都是PRV密码子偏向性的形成因素.根据RSCU值进行的对应分析表明伪狂犬病病毒大多数基因密码子用法受基因表达水平和基因功能影响.综上所述,伪狂犬病病毒偏爱于G或C结尾的密码子,且碱基组成限制、碱基突变、翻译选择和基因功能是影响伪狂犬病病毒同义密码子用法特点的主要因素.
- 殷华平郭万柱徐志文杨丽
- 关键词：碱基突变翻译选择
- 猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建
- 试验中先将PPV SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物（分别引入HindⅢ和SacⅠ两个酶切位点）扩增PCV2 SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-...
- 朱玲郭万柱蒋清蓉徐志文熊丁杰张博王印赵玲
- 关键词：猪细小病毒病毒样颗粒
- 文献传递
