国家质检总局科技计划项目(2006IK003)
- 作品数：6 被引量：75H指数：5
- 相关作者：刘荭岳志芹吕建强江育林何俊强更多>>
- 相关机构：深圳出入境检验检疫局山东出入境检验检疫局华中农业大学更多>>
- 发文基金：国家质检总局科技计划项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立被引量：16
- 2008年
- 在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测。制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.9984。组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性。与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测。
- 李惠芳吕建强岳志芹刘荭田飞焱何俊强蔡依娜陈昌福
- 关键词：实时荧光定量PCR
- 国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析被引量：21
- 2006年
- 用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。
- 刘荭范万红史秀杰陈超吕建强何俊强高隆英江育林
- 关键词：基因分析
- 锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用被引量：15
- 2007年
- 研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列(GenBank AB182940),利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为:Ct=-3.45 lgX+42.73(相关系数R2=0.989)。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。
- 范万红刘荭岳志芹吕建强何俊强江育林
- 关键词：锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR
- 杀鲑气单胞菌的实时定量PCR检测方法的建立和应用被引量：5
- 2008年
- 选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。
- 刘宗晓刘荭史秀杰高隆英岳志芹吕建强何俊强江育林谢从新
- 关键词：杀鲑气单胞菌实时定量PCRTAQMAN探针
- TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒被引量：15
- 2008年
- 根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰（Ictalurus Punctatus）病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系（r=0.998 3）,最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。
- 李惠芳刘荭吕建强蔡依娜田飞焱李香平岳志芹陈昌福
- 关键词：实时荧光定量PCR
- 常规PCR、实时定量PCR检测传染性皮下及造血器官坏死病毒的效果分析被引量：8
- 2008年
- 对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本实验首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79·8%,常规PCR检测阳性率为40·5%,表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将二者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对。结果证明,测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实时定量PCR检测IHHNV,快速、灵敏、准确,特异性好,可以作为检测对虾感染病毒的有效方法。
- 周优岳志芹梁成珠徐彪朱来华高宏伟孙敏刘荭汪东风
- 关键词：凡纳滨对虾实时定量PCR常规PCR测序
