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体细胞核移植技术生产转基因猪胚胎的研究: 2013年; 以转染绿色荧光蛋白基因的猪胎儿成纤维阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,体外成熟卵母细胞为核移植受体构建绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,研究供核细胞的处理、注核部位及重构胚融合/激活时间对转GFP克隆胚早期发育的影响.结果显示,胎儿成纤维细胞血清饥饿与非饥饿培养10 d处理组,采用卵周间隙核移植重构胚的卵裂率(82.35%和79.07%)差异不显著(P>0.05);体外培养42～44 h卵母细胞进行胞质内和卵周间隙注核的重构胚胎,其卵裂率(81.11%和76.80%)差异不显著(P>0.05);将卵周间隙注射法构建重构胚在0～1 h,2～4 h和6～8 h进行融合/激活操作,前2组重构胚卵裂率(75.61%和83.07%)无显著差异(P>0.05),但显著高于第3组(60.00%)的卵裂率(P<0.05).; 华再东刘西梅毕延震华升郑新民; 关键词：供核细胞

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨被引量：4: 2014年; 高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.; 毕延震刘西梅华再东张立苹郑新民肖红卫

Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价被引量：10: 2014年; 选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP).经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系.将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选(FACS)、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1%,DNA水平的删除效率则达到97%.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据.; 王志蕊刘西梅周荆荣郑新民魏庆信董发明毕延震; 关键词：CRE LOXP 绿色荧光蛋白删除

牛卵巢储运条件的探索被引量：1: 2013年; 试验探讨了不同条件下保存和运输牛卵巢的效果。结果表明,37℃、2 h效果最佳;25℃、9 h比较实用;而4℃保存可以在20 h以上长途运输。; 刘西梅毕延震李莉肖红卫华再东周木青华文君张立苹; 关键词：卵巢储运

体细胞核移植生产梅山猪被引量：5: 2014年; 本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2、G3、G4和G5代的融合效率差异不显著(P>0.05),但G5代作为供体细胞核移植的重组胚胎卵裂率显著高于G1、G2、G3和G4代(P<0.05);使用G5代的胎儿成纤维细胞作为供核细胞,通过手术移植的方法,将重构胚胎移植到二元后备母猪体内,结果成功地获得了体细胞克隆梅山仔猪,并且仔猪全部为雄性胎儿,说明该性别鉴定方法不但操作简单,而且准确度高;经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为中国优质猪品种改良、保种、性别控制及建立人类疾病模型等研究提供有效可行的方法,为批量生产克隆优秀种猪提供了坚实的理论基础。; 华再东郑新民魏庆信肖红卫刘西梅华文君郭帅张立苹毕延震任红艳岑文华升; 关键词：梅山猪克隆猪核移植

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响被引量：3: 2015年; 为探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的添加浓度及脱卵丘细胞时间对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。试验通过在体外成熟液中添加不同浓度(0、10、15、20、30、40ng/mL)的EGF来研究其对培养44h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响;在培养开始后的不同时间(18、24、38、44h)进行脱卵丘细胞处理来研究不同时间脱卵丘处理对培养44h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响。结果表明,成熟培养基中添加10ng/mL EGF能显著提高卵母细胞的卵裂率和囊胚率(P<0.05)。共培组和独培组卵母细胞培养18h后脱卵丘细胞成熟率均低于44h,但差异不显著(P>0.05);共培组卵母细胞培养18h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率显著高于培养44h(P<0.05);独培组卵母细胞培养18h后脱卵丘细胞的卵裂率与44h无显著差异(P>0.05),但囊胚率显著高于培养44h后脱卵丘细胞(P<0.05)。添加10ng/mL EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育较好;卵母细胞培养18h后脱卵丘细胞可提高孤雌胚胎早期发育能力。; 岑文华再东郑新民肖红卫张立苹吴民耀; 关键词：EGF 卵丘细胞体外成熟

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湖北省自然科学基金(2010CDA120)