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国家自然科学基金(30771902)
国家自然科学基金(30771902)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：张国良聂广周保罗陆坚杨桂林更多>>
- 相关机构：深圳市第三人民医院中国科学院武汉大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金东莞市科技计划项目深圳市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 甲型H1N1流感病毒NA蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备
- 2012年
- 目的:利用原核系统表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白,制备NA特异性单克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术扩增A/Shenzhen/71/09病毒株NA基因,通过原核表达系统表达含6×His标签NA重组蛋白,利用镍离子亲和柱进行纯化。使用NA蛋白以100g/只剂量免疫BALB/C小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤技术筛选分泌NA特异性单克隆抗体的细胞株,采用Western-blot方法对单抗进一步验证。结果:成功克隆A/Shenzhen/71/09NA基因,长度约1400bp。将NA基因克隆入原核表达载体pET-21b(+),经IPTG诱导后在大肠杆菌包涵体中检测到目的蛋白,分子量约50kd。采用尿素变性处理后借助6×His标签对蛋白进行纯化。用纯化蛋白免疫小鼠,将脾细胞与SP2/0细胞融合,使用ELISA检测细胞上清NA抗体,共筛选1株持续分泌NA抗体的杂交瘤细胞株7C11。Western-blot验证该单克隆抗体可以特异性结合NA抗原。结论:成功表达甲型H1N1流感NA蛋白,获得1株分泌NA抗体的单克隆细胞株,从而为后续甲流诊断及疫苗研制奠定基础。
- 林巧姚思敏张国良杨辉邓小凤杨榕青聂广郑学宝刘晋洪
- 关键词：甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶单克隆抗体
- 整合深圳人源H5N1禽流感病毒株血凝素蛋白的假型逆转录病毒的构建被引量：3
- 2009年
- 目的构建整合深圳人源H5N1禽流感病毒（avianinfluenzavirus，AIV）株血凝素（HA）的假型逆转录病毒。方法利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术扩增深圳人源H5N1禽流感病毒株HA基因，将扩增产物与pGEM-T载体连接，在经过酶切及测序鉴定后，通过Sal Ⅰ与BamHⅠ酶切位点将HA基因克隆至真核表达载体CMV／R，然后协同转移载体pHR—Luc、包装载体pCMV＆8．2通过磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞（293T），72h后收集假病毒上清，超速离心后通过Western blot鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达，同时测定HIV—HA假病毒对犬肾传代细胞（MD-CK）、宫颈癌上皮细胞（HeLa）、中国仓鼠卵母细胞（CHO）和293T等4种不同细胞株的感染活性。结果深圳人源H5N1禽流感病毒株A／Shenzhen／406H／06属于subclade2．3，其HA基因开放读码框编码567个氨基酸，在GenBank登录号为EFl37706。经Sal Ⅰ与BamHⅠ双酶切鉴定HA基因成功克隆至真核表达载体CMV／R。将pHR—Luc、pCMV＆8．2、CMV—HA共转染293T细胞后，所收集的假病毒经Westernblot证实假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24，还可以整合AIVHA蛋白，并且能够由前体蛋白HA。裂解为具有生物活性的HA，和HA：蛋白。HIV—HA假病毒可以感染MDCK、HeLa、CHO、293T等4种靶细胞，表明所构建的假病毒具有感染活力，且具有广泛的宿主范围。结论本研究成功构建整合A／Shenzherv／406H／06HA蛋白的假型逆转录病毒，并且HIV—HA假病毒具有良好的感染活性，从而为下一步筛选中和抗体及抗原表位分析奠定基础。
- 张国良周伯平陈心春蔡车国陆坚杨桂林聂广周保罗
- 关键词：H5N1型禽流感病毒血凝素假病毒逆转录病毒
