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密码子优化型鸭甲肝病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达被引量：2: 2014年; 为了提高基因A型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)VP1基因在昆虫细胞中的表达水平,本研究根据昆虫细胞密码子偏爱性对野生型DHAV VP1(wtVP1)基因进行改造,合成了optiVP1基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建了重组杆状病毒rBacmid-wtVP1和rBacmid-optiVP1,分别转染对数生长期的sf9昆虫细胞表达VP1蛋白。转染72 h后,sf9细胞出现典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE),Western-blot和间接免疫荧光法(indirect immunofl uorescence assay,IFA)检测结果表明VP1蛋白在重组杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得了良好表达。用Image J软件对Western-blot扫描的图片进行灰度分析发现,optiVP1基因在昆虫细胞中的表达水平明显高于wtVP1。本研究为进一步研制诊断抗原和新型基因工程疫苗的开发奠定了基础。; 李传峰陈宗艳孟春春梁瑞英胡文刘光清; 关键词：VP1 重组杆状病毒密码子优化

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位被引量：2: 2012年; 为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。; 王超李传峰陈宗艳付玉志吴润刘光清; 关键词：鸭病毒性肝炎病毒亚细胞定位

北京鸭RIG-I基因的克隆及其生物信息学分析被引量：4: 2015年; 应用RT-PCR方法,从北京鸭组织中扩增维甲酸诱导基因I(rerinotic acid inducible gene I,RIG-I),用DNA Star等生物软件分析其所含的生物信息,并构建系统进化树。扩增出的北京鸭RIG-I基因(Gen Bank登录号:KM455977)全长2 802 bp,编码933个氨基酸。RIG-I具有RLR家族的典型特征,即N端含两个半胱天冬酶活化和募集结构域,C端包括RNA解旋酶,ATP结合结构域,RNA结合结构域和抑制结构域,RIG-I蛋白二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。序列比对和系统进化分析结果表明,RIG-I的序列在同种之间比较保守,与已报道的鸭RIG-I的同源性高达98%以上;但与鹅RIG-I同源性稍低,为95.9%;与人、鼠、草鱼的同源性较低,分别为62.3%,61.5%,61.2%;与猪的同源性最低,仅为54.4%。成功克隆了鸭的RIG-I基因,可为今后开展鸭的天然免疫研究及研发新型疫苗等奠定基础。; 王同淑李传峰陈宗艳孟春春吴润刘光清; 关键词：RIG-I 克隆生物信息学分析进化树

以J亚型禽白血病病毒LTR为启动子的真核表达载体构建: 2013年; 为构建以J亚型禽白血病病毒(ALV-J)的LTR元件为启动子的真核表达载体,本研究将ALV-J LTR克隆至pBluescript II SK(+)载体中,并在5'LTR和3'LTR之间分别插入报告基因(eGFP)和新城疫病毒(NDV)的NP基因,得到重组质粒pSK-LTR-GFP和pSK-LTR-NP。将上述重组质粒分别转染293T细胞、BHK-21细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF),应用RT-PCR、western blot和荧光显微镜检测目的基因的表达。结果表明,无论是在哺乳动物细胞(BHK-21和293T)还是在禽原代细胞中,LTR均能够启动外源基因(eGFP和NP)良好转录和表达。流式细胞技术分析显示,报告基因在293T细胞中的表达在48 h达到峰值。本研究为利用ALV-J LTR元件构建输送或表达外源基因的质粒载体奠定了基础。; 王蓓陈宗艳李传峰孟春春王桂军刘光清; 关键词：禽白血病病毒启动子 LTR

鸭甲型肝炎病毒衣壳蛋白B细胞抗原表位和密码子偏爱性的分析被引量：2: 2012年; 为了筛选血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV)衣壳蛋白的优势B细胞抗原表位及其各结构蛋白的最佳宿主表达系统,通过RT-PCR获得DHAV衣壳蛋白的编码基因(P1基因)序列,并分别运用DNAStar和EMBOSS软件分析其B细胞抗原表位区和密码子偏爱性特征,然后进行各结构蛋白抗原性的Western-bolt分析以及与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较。结果显示,DHAV的优势B细胞抗原表位主要存在于VP1和VP3蛋白,且每种蛋白各包含2个潜在的优势B细胞抗原表位。DHAV 3种结构蛋白基因的ENc值分别为54.631、49.502和45.924。VP3和VP1蛋白与酵母的密码子偏爱性差异最小,VP0蛋白与人的密码子偏爱性差异最小。结果表明,3种结构蛋白密码子出现的频率较为均一。VP1和VP3蛋白均是DHAV基因工程疫苗研制的候选免疫原,且适宜在酵母表达系统中表达,而VP0蛋白更适宜在人源细胞中表达。; 李传峰陈宗艳刘光清; 关键词：B细胞抗原表位密码子偏爱性

鸭甲肝病毒VP1蛋白主要抗原域的原核表达及间接ELISA方法的初步建立: 2015年; 根据已发表的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)疫苗株A66株基因组序列,利用生物学分析软件DNAStar进行VP1蛋白的二级结构和抗原域预测,确定其主要抗原域(major antigen domain of VP1,VP1M),设计并合成一对可扩增VP1M的特异性引物,PCR扩增获得长为327 bp的VP1M基因片段。将VP1M基因片段定向克隆至p GEX-4T-1表达载体中,鉴定正确后进行IPTG诱导表达,获得了以包涵体为主的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经过Western blot检测表明重组蛋白具有良好的抗原性。以该蛋白作为包被抗原,成功建立了检测DHAV-1的间接ELISA方法。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DHAV的快速诊断、流行病学调查和免疫鸭群的抗体检测提供了快速实用的检测手段。; 孙涛李传峰徐彪邓明俊岳志芹; 关键词：VP1 间接ELISA

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