国家高技术研究发展计划(2012AA101301)
- 作品数：19 被引量：78H指数：4
- 相关作者：吕建强杨俊兴花群义陶虹周泽扬更多>>
- 相关机构：深圳出入境检验检疫局重庆师范大学西南大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技支撑计划国家质检总局科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程更多>>
- 小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达和免疫学活性鉴定被引量：2
- 2014年
- 研究小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白生物学活性,为建立PPRV抗体检测方法提供材料。根据GenBank已发表的PPRV H蛋白质序列,设计上、下游引物,以PPRV核酸为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆至pET52/LIC载体中,构建了pET52/LIC-PPRV H表达载体。将pET52/LIC-PPRV H重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳分析,可见PPRV H蛋白成功得到了表达,融合蛋白的分子质量约为75ku,Western blot分析表明所表达的重组蛋白可与PPRV阳性血清发生特异性反应,说明表达的PPRV H蛋白可以作为建立PPRV抗体检测的蛋白。
- 陶虹孙洁李健波刘建利阮周曦张彩虹曹琛福吕建强花群义杨俊兴
- 关键词：小反刍兽疫病毒原核表达
- 非洲猪瘟病毒p54基因的原核表达及其抗体的间接ELISA检测方法的建立被引量：21
- 2014年
- 将非洲猪瘟病毒P54基因克隆到原核表达载体pET-52b(+)3C/LIC中,转入BL21(DE3)菌中诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析的结果表明,表达蛋p54的分子质量约为28ku,具有很好的抗原性。纯化p54蛋白后,采用2.5μg/mL浓度作包被抗原,建立了检测非洲猪瘟p54抗体的间接ELISA方法,结果表明建立的间接ELISA方法特异性、敏感性都较好。
- 曹琛福梁云浩陶虹花群义曾少灵杨俊兴陈兵张桂红吕建强
- 关键词：非洲猪瘟病毒原核表达间接ELISA
- 小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2019年
- 本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。
- 孙洁廖立珊曾绍英朱琳陶虹林庆燕黄超华花群义杨俊兴
- 关键词：小反刍兽疫卵黄抗体双夹心ELISA
- 应用生物素标记和蛋白质组学方法分离鉴定柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的表面蛋白被引量：2
- 2015年
- 建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和2%SDS的混合液裂解结合超声波破碎的方法能提取到更多的微孢子虫总蛋白质;用30%乙腈和70%甲酸配合沸水浴处理可有效洗脱微孢子虫表面蛋白。对得到的柞蚕微孢子虫表面蛋白检测样品进行LC-MS/MS质谱鉴定,共获得了8个假定的表面蛋白,其中分子质量为26.6 k D(Np SWP12)、25.7 k D(Np SWP26)、32.0 kD(Np SWP30)的3个假定蛋白经间接免疫荧光分析确证为定位在孢子表面的蛋白质。序列分析显示,NpSWP12、NpSWP26、NpSWP30与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白NbSWP12、NbSWP26、NbSWP30的氨基酸序列相似度分别为100%、93%、79%,其中Np SWP26无N-糖基化位点和O-糖基化位点,但C端具有介导孢子粘附宿主细胞的肝素结合基序。分离鉴定的3个表面蛋白可以作为柞蚕微孢子虫侵染机制研究和早期检测的靶标蛋白。
- 赵唯希王林玲刘泽锋周泽扬李治
- 关键词：柞蚕微孢子虫表面蛋白生物素-亲和素系统
- 小反刍兽疫病毒竞争ELISA检测试剂盒生产工艺研究被引量：2
- 2014年
- 为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。
- 刘晓慧杨云庆叶玲玲祝贺吕建强赵文华颜红尹尚莲花群义杨仕标张光培周晓黎董俊艾军
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体竞争ELISA
- 一种适于意大利蜜蜂中肠总蛋白提取方法的建立和应用被引量：1
- 2015年
- 依次采用不锈钢珠破碎结合IPG裂解液法、液氮研磨结合IPG裂解液法、液氮研磨结合PBS裂解液法和不锈钢珠结合PBS裂解液法提取意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,Ap）中肠总蛋白,并通过SDS-PAGE对获得的总蛋白进行质量检测。结果显示,与其他3种方法相比,利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合PBS裂解液法能够提取并获得丰度较高的Ap中肠总蛋白,蛋白质种类较多,分子量大小为18.4~116kD,样品的电泳条带清晰可见。应用该方法还开展了Ap感染东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae,Nc）后中肠组织蛋白质的差异表达分析,结果显示感染Nc的Ap中肠出现了蛋白质的上调表达;同时SDS-PAGE结果显示该方法也适用于中华蜜蜂（Apis cerana cerana Fabricius）中肠总蛋白的提取。利用不锈钢玻璃珠破碎处理结合PBS裂解液法提取Ap中肠总蛋白方法的建立将有助于对蜜蜂中肠蛋白进行鉴定分析,为深入研究蜜蜂中肠蛋白质组成、功能及其肠道免疫机制奠定基础。
- 张素贞许金山马振刚周泽扬
- 关键词：蜜蜂中肠总蛋白
- 非洲猪瘟病毒p72蛋白的真核表达及反应原性鉴定被引量：2
- 2015年
- 将p72基因克隆到载体pFast Bac/NT-TOPO上,转化大肠埃希菌DH5α。将获得的重组载体pFastBac/NT-TOPO-p72,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒质粒bacmid-p72。通过脂质体介导,将bacmid-p72转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染正常生长的sf9细胞,72h后收集细胞,超声破碎后取上清进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,重组蛋白大小约78ku,且重组蛋白可以与非洲猪瘟标准阳性血清反应。说明表达的重组蛋白为可溶性的,并具有良好的反应原性。
- 梁云浩曹琛福叶奕优花群义张彩虹曾少灵陶虹廖立珊刘建利唐勇吕建强
- 关键词：非洲猪瘟病毒脂质体介导重组杆状病毒
- 非洲猪瘟病毒p30蛋白真核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2016年
- 本文设计特异性引物扩增全长p30基因,得到585bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac/NT-TOPO中,转化大肠杆菌DH10Bac进行同源重组,成功构建了含有p30基因的真核表达载体。转染Sf9细胞,回收得到重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达产物20kDa,与预期大小一致,能与AFSV阳性血清产生特异性反应。
- 廖立珊孙洁刘建利花群义唐金明林彦星阮周曦张彩虹陶虹吕建强杨俊兴秦智锋林庆燕曾少灵
- 关键词：ASFV杆状病毒表达
- 非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立被引量：20
- 2014年
- 以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。
- 靳雯雯杨俊兴花群俊刘建利曹琛福曹胜波曾少灵陶虹阮周曦吕建强
- 关键词：非洲猪瘟病毒间接ELISA
- 非洲猪瘟病毒p54抗原蛋白卵黄抗体的制备及生物活性检测被引量：4
- 2016年
- 为研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54抗原蛋白及其相应卵黄抗体的生物学特性,特制备ASFV p54蛋白及相应鸡卵黄抗体。可溶性表达制备高纯度ASFVp54抗原蛋白,并制定合理的免疫程序,免疫产蛋母鸡,定时采血并收集鸡蛋。卵黄液经粗提取后二次盐析,制备特异性卵黄抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示,在首次免疫后7d后的血清中即可检测出相应抗体,14d后在卵黄中提取到相应抗体,35d后IgY效价达到峰值。经SDS-PAGE检测,制备所得纯度达到90%,得率在8.8g/L以上。Western-blot检测结果显示,纯化的IgY具有高度的特异性。
- 高又文刘建利张彩虹吕建强樊惠英
- 关键词：卵黄抗体生物活性
