江苏省自然科学基金(BK2008530)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 相关作者：黄飚王柯杨润林徐娟周彬更多>>
- 相关机构：卫生部江苏省原子医学研究所江南大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 基于ELISA、TRFIA及AlphaScreen技术的血管内皮生长因子受体3拮抗剂筛选模型的构建及比较被引量：2
- 2011年
- 血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)为淋巴管特异标记物,与肿瘤淋巴管生成和转移具有明显的相关性,VEGFR-3胞内域的酪氨酸激酶(TK)直接参与了胞内信号转导途径,因此VEGFR-3 TK抑制剂可能成为抑制肿瘤淋巴道转移的有效药物。采用大肠杆菌成功表达人源VEGFR-3酪氨酸激酶(VEGFR-3 TK),并以其为靶点,分别构建了基于ELISA,TR-FIA及AlphaScreen技术的高通量药物筛选模型,并从反应条件、方法学参数及相关性等方面对这三种模型进行了评估及比较。AlphaScreen采用均相反应系统,反应速度最快。TRFIA和AlphaScreen由于采用了稀土离子作为标记物,其灵敏度和检测范围大大高于ELISA,且自动化程度高。样品检测结果表明,三种方法的相关性较好,其中TRFIA和AlphaS-creen技术适用于大规模药物筛选,具有很好的应用前景。
- 王柯杨润林徐娟周彬朱岚黄飚
- 关键词：血管内皮生长因子受体3酪氨酸激酶时间分辨荧光免疫分析
- 人体中可溶性VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
- 2011年
- 针对人体血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEG-FR-2)受体型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达,并对表达和纯化条件进行优化。构建表达VEGFR-2酪氨酸激酶重组大肠杆菌,通过研究不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和超声条件等对蛋白表达的影响,采用Ni-NTA亲和层析法、Western Blot法ELISA方法对重组蛋白进行纯化、鉴定和活性测定。成功地将1 000 bp左右的VEGFR-2酪氨酸激酶DNA片段插入载体pQE30中,在优化条件下重组蛋白较好地可溶性表达。SDS-PAGE表明重组蛋白相对分子质量约为36 000,与预期一致,Western Blot分析表明它能与抗Flk-1和抗His抗体特异反应,ELISA检测结果表明重组蛋白具有利用ATP催化底物磷酸化的激酶活性。通过重组DNA技术使人体VEGFR-2酪氨酸激酶在大肠杆菌得到可溶性表达,纯化重组蛋白具有较高的活性。
- 徐娟王柯杨润琳黄飚段作营李华钟
- 关键词：纯化活性测定
