国家自然科学基金(30300010)
- 作品数：14 被引量：150H指数：5
- 相关作者：徐琪寿郭长江张绪梅刘云李剑欣更多>>
- 相关机构：军事医学科学院南昌大学解放军第306医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金天津市科技攻关项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生轻工技术与工程化学工程更多>>
- 大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达被引量：4
- 2007年
- 目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。
- 李剑欣郭长江刘云林维平张绪梅徐琪寿
- 关键词：色氨酸生物合成
- 基因工程在L-色氨酸生产中的应用研究进展被引量：8
- 2005年
- 尽管L-色氨酸的生产已取得诸多进展,但由于其合成代谢途径长、调控复杂,故一直未能达到工业化生产的要求。本文主要概述近年来通过构建色氨酸合成酶和色氨酸酶基因工程菌株与酶法相结合来生产L-色氨酸方面的进展及其局限性,并从增加前体物质代谢流、限速酶量和消除途径抑制因素等方面着重论述第三代基因工程———代谢工程在L-色氨酸生产方面的研究状况,指出代谢工程育种为今后色氨酸育种的主要方向。
- 张绪梅郭长江李剑欣徐琪寿
- 关键词：L-色氨酸基因工程代谢工程
- qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达被引量：21
- 2006年
- 奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的关键和基础。粗糙脉孢菌基因组中编码奎尼酸脱氢酶的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有8个,编码Gly(G)的有9个。编码精氨酸的AGG(AGA)两个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区。进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3kJ/mol降低到最小-80.5kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小。通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础。
- 刘礼兵刘云何华庆李永辉徐琪寿
- 关键词：密码子MRNA二级结构
- 大肠杆菌trpBA和serA基因的串联表达被引量：4
- 2009年
- 大肠杆菌trpBA基因编码的色氨酸合成酶（tryptophan synthetase，TSase）是色氨酸合成的关键酶；serA基因编码的磷酸甘油酸脱氢酶（D-3-phosphoglycerate-dehydrogenase，PGDH）为L-丝氨酸合成（色氨酸合成的底物）的关键酶。为了通过基因工程手段来增加色氨酸的产量，在利用高效的原核表达载体pET22b（＋）分别对trpBA和serA基因克隆表达的基础上，采用PCR方法扩增了抗反馈抑制的serA和trpBA基因，将两基因串联于pET22b（＋）载体上，共构建了4种方式的串联质粒，实现了2种蛋白酶在大肠杆菌中的共表达。聚丙烯酰胺电泳分析显示，ABA—I重组菌株在37kD（PGDH）、29kD（色氨酸合成酶的α,亚基）、44kD（β亚基）处均有明显的蛋白表达带。4种串联表达质粒重组菌的TSase酶活性，分别比含空载体菌相应酶的活性提高2～4倍，PGDH酶活性分别提高约2．1～3．6倍。经摇瓶发酵实验表明酶活性较高的ABA—I菌株色氨酸合成量亦最高，约为对照菌株的20．2倍。
- 张绪梅郭长江刘云徐琪寿
- 关键词：色氨酸大肠杆菌
- 系统生物技术——组学时代的代谢工程
- 2007年
- 高通量实验技术的广泛应用产生了海量数据,利用生物信息学工具整合这些数据,加深了人们对细菌生理活动规律的认识,系统生物学应运而生。系统生物学的出现使代谢工程从局部通路水平上升到整体水平,代谢工程也因此进入了新的发展阶段——系统生物技术时代。系统生物技术通过整合各个层次组学数据,建立数学模型,或通过比较不同菌株或同一菌株在不同条件下基因组、转录组、蛋白组或代谢组的差异以阐明生命活动规律,在此基础上,对影响表型的靶基因进行改造,得到符合预期的表型。随着新的高通量实验技术的不断运用以及生物信息学的发展,系统生物技术必将取得更大进步。
- 于金龙黄英武徐琪寿
- 关键词：系统生物技术代谢工程基因组转录组蛋白组
- 大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控研究被引量：6
- 2008年
- 为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量,对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造。首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控,进而又敲除了tnaA基因,阻断了色氨酸的分解代谢。然后,将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达,以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈。与对照MG1655相比,trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍,双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍。pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168mg/L,而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后,色氨酸浓度提高到820mg/L。为构建色氨酸高产菌奠定了基础。
- 于金龙王静李剑欣郭长江黄英武徐琪寿
- 关键词：色氨酸
- 发酵液中色氨酸含量高通量快速测定被引量：2
- 2008年
- 为了高通量筛选色氨酸工程菌，利用色氨酸与MAA在酸性条件下产生荧光物质（激发波长253nm，发射波长450nm），荧光强度与色氨酸含量在一定范围内成正比的原理，建立了96孔微孔板中高通量测定发酵液色氨酸含量的方法。反应液80℃反应15min后，测量荧光强度。线性范围为1mg·L^-1～100mg·L^-1，为大规模筛选色氨酸基因工程菌打下了基础。
- 于金龙郭长江黄英武徐琪寿
- 关键词：色氨酸高通量荧光测定
- 脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆和表达被引量：3
- 2004年
- 目的 :克隆表达大肠杆菌脱氢奎尼酸合成酶基因aroB ,并测定其生物学活性。方法 :根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物 ,利用PCR技术扩增得到aroB基因 ,将其克隆入pGEM Teasy载体中 ,以双脱氧法进行测序 ,然后再克隆入高效原核表达载体pBV2 2 0 ,对该重组子的SD序列进行调节后利用温度诱导表达 ,并测酶的生物活性。结果 :构建了aroB基因的克隆和表达重组子 ,经SD序列调节后 ,aroB基因获得高效表达 ,SDS PAGE图谱显示新增 38.8× 10 3 蛋白带 ,酶活性测定结果表明脱氢奎尼酸合成酶的相对酶活性为 5 .4。结论 :实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达 ,为构建产脱氢奎尼酸工程菌种奠定了基础。
- 常会波刘云吴建新徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌基因表达
- 大肠杆菌trpBA基因的克隆表达被引量：5
- 2006年
- 目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b(+)中,得到重组质粒pet22b(+)-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b(+)-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。
- 张绪梅郭长江刘云杨继军韦京豫徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌克隆酶活性
- 大肠杆菌PGDH末端缺失突变体的构建及抗反馈抑制效应分析被引量：8
- 2006年
- 为了获得具有抗反馈抑制性质的大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH,d-3-phosphoglycerate dehydrogenase,EC 1.1.1.95）,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,用PCR突变法构建突变酶M1（缺失第410位氨基酸）、M2（缺失407～410位氨基酸）、M3（缺失337～410位氨基酸）.M0（野生型）及各突变型基因与pET22b（＋）载体连接后,表达融合蛋白.在非变性条件下,由NTA-Ni镍离子螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白.酶活性测定结果表明,M1、M2蛋白酶均保持了原有的野生型磷酸甘油酸脱氢酶活性,且部分解除了终产物L-丝氨酸的反馈抑制作用;M3蛋白酶完全解除了终产物的反馈抑制作用,但酶本身的催化活性略有降低（为野生型的83%）.M0、M1、M2菌株PGDH与L-丝氨酸结合的Ki值分别约为7μmol/L、20μmol/L、50μmol/L,说明该酶C末端1～4个氨基酸残基对L-丝氨酸和调控区的结合有重要影响.
- 张绪梅郭长江刘云杨继军韦京豫徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌蛋白纯化缺失突变体
