重庆市自然科学基金(CSTC2007BA5012)
- 作品数：4 被引量：1H指数：1
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- 相关机构：重庆医科大学军事医学科学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立
- 2009年
- 目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论:成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。
- 张琴卜友泉易发平袁成福秦琴宋方洲
- 关键词：真核表达载体基因表达
- JNK3重组腺病毒促进表柔比星诱导的人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡被引量：1
- 2008年
- 目的:构建人JNK3基因重组腺病毒,检测其对人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响;以表柔比星作为凋亡诱导剂,检测其对细胞凋亡的影响。方法:以pDBLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-JNK3,线性化后与骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增,经PCR方法鉴定后,用包装后的病毒上清感染人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,Western印迹方法检测JNK3蛋白的表达;MTT实验检测其对细胞增殖的影响;流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测表柔比星诱导的细胞凋亡情况。结果:核酸测序和PCR鉴定表明成功构建Ad-JNK3,终点稀释试验测定扩增的腺病毒滴度为6.5×1010pfu/ml;Ad-JNK3在SH-SY5Y细胞中表达JNK3蛋白;MTT检测结果表明Ad-JNK3可抑制SH-SY5Y细胞生长,抑制率为28.08%;流式细胞术结果表明Ad-JNK3可明显促进表柔比星诱导的细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳可观察到DNA梯形条带。结论:重组腺病毒Ad-JNK3能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖,促进表柔比星诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,为研究JNK3的作用机制及将其用于人成神经细胞瘤的基因治疗提供了条件。
- 韩卿宋方洲易发平卜友泉王治东李长燕杨晓明
- 关键词：JNK丝裂原活化蛋白激酶类重组腺病毒表柔比星细胞凋亡
- 黑色素浓集激素受体2基因siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定
- 2008年
- 目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)siRNA重组腺病毒载体,并在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上,得到pSES-HUS-MCHR2siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染稳定表达MCHR2的CHO细胞株,RT-PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响.结果:成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体.MCHR2siRNA重组腺病毒显著抑制CHO细胞中MCHR2的表达.结论:构建的Adeasy-MCHR2 siRNA腺病毒能有效地抑制CHO细胞中MCHR2表达,为研究MCHR2的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具.
- 张琴袁成福卜友泉易发平武向梅袁飞秦琴宋方洲
- 关键词：腺病毒载体RNA干扰
- 稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立
- 2008年
- 目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1(+)MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系。方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达。结果:扩增出MCHR2的全长cDNA;成功构建pcDNA3.1(+)MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株。结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础。
- 张琴卜友泉易发平袁成福袁飞宋方洲
- 关键词：真核表达载体基因表达
