国家自然科学基金(81073156) 作品数:11 被引量:83 H指数:7 相关作者: 赵红斌 张全伟 张明 陈亚男 赵玲 更多>> 相关机构: 兰州军区兰州总医院 甘肃中医药大学 兰州大学 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 更多>>
cAMP/Ca^(2+)信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化中的作用和机制 被引量:7 2017年 本研究旨在探讨cAMP/Ca^(2+)信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞定向分化中的作用机制。将骨髓间充质干细胞株D1细胞分为空白对照组和红景天苷诱导组,空白对照组细胞加入不含药物的等量D/F12完全培养液,诱导组细胞加入含有100 mg·L^(–1)红景天苷的D/F12完全培养液分别作用24、48和72 h。运用RT^2 Profiler PCR Array方法检测红景天苷诱导BMSCs不同时间后c AMP/Ca^(2+)信号通路中差异表达的基因。实验表明,红景天苷分别诱导BMSCs 24、48和72 h后,与空白对照组比较,表达有差异的基因共38个,其中上调基因23个,下调基因15个,经过筛选上调较显著的基因有4个:DNA损伤诱导因子3(Ddit3)、热休克蛋白5(Hspa5)、磷酸酶1调节亚单位15a(Ppp1r15a)、前列腺素内过氧化物合酶(Ptgs2);下调显著的基因有4个:胰高血糖素(Gcg)、白细胞介素2(Il2)、肿瘤坏死因子(Tnf)、生长激素抑制素(Sst)。这些基因可能对红景天苷诱导BMSCs向神经元细胞的定向分化具有一定影响。 赵玲 赵红斌 秦文 李根 唐俊杰 王九娜关键词:红景天苷 骨髓间充质干细胞 神经元细胞 Notch和BMP信号通路介导红景天苷促进小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化研究 被引量:13 2016年 目的探讨BMP和Notch信号通路介导红景天苷诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞定向分化的分子机制。方法实验分为对照组、红景天苷诱导组和阻断组。利用细胞免疫荧光化学方法、Real-Time PCR方法和Western blotting方法分别研究了红景天苷对MSCs的增殖、形态以及对BMP和Notch信号通路的影响。结果红景天苷影响MSCs的增殖且促进其形成神经元样细胞;细胞免疫荧光结果显示,红景天苷可降低Notch1和Jadge1阳性表达率(P〈0.05);红景天苷诱导细胞12-72 h时,Notch1和Hes1 m RNA表达丰度明显下调(P〈0.05);特异性阻断剂DAPT阻断Notch信号通路后,神经元细胞标志分子NSE、MAP-2和β-tubulin III m RNA和NSE、β-tubulin III蛋白的表达水平与阻断前比较显著上调(P〈0.05)。12 h时Smad5和Smad8 m RNA的表达水平显著上调(P〈0.01),且12和24 h时Smad1/5/8蛋白表达上调(P〈0.05);Noggin阻断BMP信号通路后,NSE、MAP-2和β-tubulin III m RNA的表达丰度与诱导组比较明显下调(P〈0.05);DAPT和Noggin同时阻断Notch和BMP信号通路后,与单独阻断BMP信号通路后比较,MAP-2和β-tubulin III m RNA的表达上调,NSE和β-tubulin III蛋白的表达水平上调(P〈0.05)。结论红景天苷通过抑制Notch信号通路、激活BMP信号通路诱导MSCs向神经元细胞定向分化。 赵红斌 甄英丽 田蓉 张全伟 甄平关键词:红景天苷 骨髓间充质干细胞 NOTCH信号通路 神经元细胞 红景天苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞 被引量:9 2012年 背景:前期实验证明红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,但是具体的影响方式尚不清楚。目的:以骨髓间充质干细胞为研究对象,进一步探讨红景天苷诱导其向神经元样细胞定向分化的作用方式和分子机制。方法:选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,按照不同的诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组,通过不同的时间点对细胞进行观察。结果与结论:两诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白、神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组(P<0.01);神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组(P<0.01)。RealTime-PCR结果显示,维甲酸和红景天苷诱导不同时间,两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2mRNA表达,与诱导时间有关且不完全相同,两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高丰度出现于诱导早期;诱导后两组神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加,兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期。说明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其诱导效应与维甲酸相似,且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸。 张全伟 赵兴绪 赵红斌 张明 杨银书 葛宝丰关键词:红景天苷 维甲酸 骨髓间充质干细胞 神经元样细胞 红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的Ca^(2+)/CaM信号通路 被引量:4 2014年 背景:课题组前期研究表明,红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,Ca2+信号是实现其生物学信号传导的重要途径之一目的:探讨Ca2+/CaM信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化中的作用及机制。方法:实验分为空白对照组和红景天苷诱导组,红景天苷诱导组将不同质量浓度红景天苷(5,10,20,50,100 mg/L)作用骨髓间充质干细胞24 h和100 mg/L红景天苷作用骨髓间充质干细胞12,24,48,72 h。采用Western blot方法分别检测红景天苷诱导骨髓间充质干细胞后神经标志分子MAP2和Ca2+/CaM信号通路中关键蛋白CaM、CaMKⅡ的表达水平。另外实验设阻断剂组,分别加Ca2+信号通路特异性阻断剂:500μmol/L EGTA(细胞外Ca2+螯合剂)、1 mmol/L Nifedipine(L型Ca2+通道阻断剂)、10 mmol/L LY294002(PI3K抑制剂)分别作用细胞30 min后,再加入100 mg/L红景天苷作用细胞24 h,采用Western blot方法检测阻断Ca2+/CaM信号通路后NSE、CaM的表达情况。结果与结论:1红景天苷诱导后,MAP2的表达上调(P<0.01),说明红景天苷可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞。2不同质量浓度红景天苷诱导骨髓间充质干细胞24 h后,10 mg/L红景天苷组CaM、CaMKⅡ的表达与其他诱导组比较显著上调(P<0.01);同一质量浓度红景天苷诱导72 h后CaM、CaMKⅡ表达明显下调(P<0.01)。3阻断细胞外Ca2+和PI3K信号通路后,NSE与CaM的表达水平较红景天苷诱导组上调(P<0.05)。结果表明,红景天苷通过抑制Ca2+/CaM信号通路实现骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化。 赵玲 赵红斌 潘茜 李根 王九娜 唐俊杰关键词:干细胞 骨髓干细胞 红景天苷 骨髓间充质干细胞 红景天苷通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化 被引量:8 2012年 目的:以小鼠骨髓间充质干细胞系D1细胞为研究对象,探讨Wnt/β-catenin信号通路介导的红景天苷诱导D1细胞向神经细胞的定向分化。方法:实验分为对照组(D/F12完全培养基)和红景天苷诱导组(100μg/mL+D/F12完全培养基).将细胞分别诱导12、24、48和72 h后,采用细胞免疫荧光化学染色方法检测β-catenin和Gsk-3β的阳性细胞率。利用红景天苷分别诱导MSCs 1,2,8,12,24,48和72 h后,利用实时PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达;采用Westernblot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72 h后,β-catenin和Gsk-3β蛋白的表达;运用Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot方法分析红景天苷对β-catenin和NSE蛋白表达的影响。结果:红景天苷诱导24 h时β-catenin的阳性率可达55.76%,与其他组和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),诱导24 h后Gsk-3β的阳性率与其他时间和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实时PCR检测结果显示,红景天苷诱导MSCs不同时间能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a、Ax-in2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达,诱导不同时间Wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达不尽相同。Westernblot结果表明,红景天苷诱导D1细胞12 h和24 h时β-catenin蛋白的表达明显上调,且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05);随着作用时间的延长,Gsk-3β蛋白的表达增加且差异具有统计学意义(P<0.05),阻断Wnt/β-catenin信号通路后,β-catenin和NSE蛋白的表达水平明显下调。结论:红景天苷能诱导D1细胞定向分化为神经元样细胞,红景天苷通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现其诱导MSCs向神经细胞定向分化。 朱晓娟 耿排力 赵红斌 张全伟 陈亚男 白洁关键词:红景天苷 Β-CATENIN信号通路 神经元细胞 红景天苷对小鼠MSCs的增殖及其细胞周期的影响 被引量:3 2016年 目的本研究探讨了不同浓度红景天苷通过ERK信号通路对小鼠骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期变化的影响及机制。方法实验分为对照组(D-MEM/F-12完全培养液)、不同浓度红景天苷(5-100μg/mL)诱导组和阻断组(5-100μg/mL+30μg/L PD98059),利用CCK8法、流式细胞术及Western blot分别检测ERK信号通路阻断前后细胞抑制率、细胞周期及其相关蛋白的表达。结果 10μg/mL诱导组和阻断组均能抑制细胞增殖,且5μg/mL(P〈0.01)、25μg/mL(P〈0.05)和100μg/mL(P〈0.05)诱导组对细胞抑制显著高于阻断组。25μg/mL诱导组和阻断组G0/G1期细胞比例均增加,细胞周期阻滞于G0/G1期。诱导组和阻断组cyclin A和cyclin D1蛋白的表达与对照组比较均下调,P21蛋白的表达上调。阻断组cyclin A蛋白的表达与诱导组比较明显下调(P〈0.01);50和100μg/mL诱导组与阻断组相比cyclin D1蛋白表达显著下调,P21蛋白的表达显著上调(P〈0.01)。结论红景天苷能通过调节细胞周期相关蛋白的表达抑制小鼠MSCs细胞的增殖和细胞周期的改变。 秦文 李晓云 杨霄鹏 潘茜 赵红斌关键词:红景天苷 MSCS 细胞周期 ERK信号通路 Wnt/β-catenin信号通路介导红景天苷诱导间骨髓充质干细胞向神经细胞定向分化研究 被引量:12 2015年 目的探讨红景天苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchyma stem cells,MSCs)向神经元细胞定向分化的分子机制。方法以小鼠MSCs系D1细胞为研究对象,实验分为阴性对照组(完全培养液)、阳性对照组(含1 mmol/Lβ-巯基乙醇)、红景天苷组(20 mg/L红景天苷)和阻断组(20 ng/m L DKK1);1×104个/孔细胞接种于6孔板24 h后分组,荧光免疫化学方法观察阴性对照组、阳性对照组和红景天苷组中β-链蛋白(β-catenin)的表达;RT-PCR法检测阴性对照组、阳性对照组、红景天苷组中神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)、抗微管蛋白(beta 3 classⅢtubulin,β-tubulinⅢ)、孤儿核受体相关因子1(nuclear receptor related factor1,Nurr1)、神经胶质原纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA和阻断组Wnt3a、β-catenin、低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein6,LRP6)、轴蛋白(Axin)mRNA的表达;Western blot分析阴性对照组、阳性对照组和红景天苷组中β-catenin和NSE蛋白的表达。利用胞外Ca2+螯合剂乙二醇双四乙酸[EGTA(胞外Ca2+螯合剂)]、细胞膜Ca2+通道阻断剂硝苯地平(Nifedipine细胞膜Ca2+通道阻断剂)和LY294002(IP3Ks特异抑制剂)分别阻断细胞不同Ca2+信号阻断剂,RT-PCR检测红景天苷组和阻断组中Wnt3a、LRP-6、Axin、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK-3)和β-catenin mRNA的表达;Western blot法分析β-catenin蛋白的表达。结果与阳性对照组比较,红景天苷组β-catenin为强阳性表达,Wnt3a、β-catenin、LRP6、Axin mRNA表达明显上调(P<0.01);NSE、β-tubulinⅢ、Nurr1 mRNA和NSE蛋白表达上调(P<0.01);与阳性对照组和红景天苷组比较,阻断组β-catenin、NSE、Nurr1和β-tubulinⅢmRNA表达降低,β-catenin和NSE蛋白表达下调(P<0.01)。与红景天苷组比较,尼莫地平组、EGTA、LY294002组Wnt3a、LRP-6、β-catenin和Axin mRNA及蛋白表达降低,β-catenin蛋白表达降低(P<0.0 郭超 刘润 赵红斌 秦冠华关键词:红景天苷 WNT/Β-CATENIN信号通路 神经细胞 红景天苷对大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的影响 被引量:22 2012年 目的探讨传统中药红景天苷诱导大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的作用及影响,以期为红景天苷应用于干细胞治疗神经系统疾病提供理论依据。方法取4~6周龄Wistar大鼠(体重约120 g)2只分离、培养BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定。取第2代细胞,根据诱导方法不同将实验分为红景天苷诱导组(A组)、维甲酸诱导组(B组)和空白对照组(C组),A、B组BMSCs分别采用红景天苷(20μtg/mL)和维甲酸(5μmol/mL)诱导培养1、3、6、9 d,MTT法检测细胞增殖活力;细胞免疫荧光染色检测神经细胞相关标志分子神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、神经微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)及NGF的表达;RT-PCR检测NSE、β-TubulinⅢ、GFAP、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA的表达;ELISA法测定培养液中BDNF和NGF含量;Western blot检测NGF蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测显示,CD90和CD106阳性,CD34和CD45阴性,实验细胞为BMSCs。A、B组诱导培养6 d和9 d,细胞增殖活力较C组明显增强(P<0.05)。RT-PCR检测示,A组诱导培养6 d,NSE、BDNF、β-TubulinⅢ、GFAP mRNA表达丰度上调至峰值。B组诱导培养6 d,NSE mRNA表达丰度上调至峰值;1 d时BDNF mRNA表达丰度上调,6 d时达峰值;3 d时β-TubulinⅢmRNA表达丰度上调至峰值;1 d时GFAP mRNA表达丰度达峰值,与其余各时间点及C组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。各组各时间点均未见GABA mRNA表达。细胞免疫荧光染色示,诱导培养3 d,A、B组NSE、MAP2、β-TubulinⅢ和GFAP阳性率与C组比较差异均有统计学意义(P<0.01);A、B组诱导培养3、6、9 d,Ach阳性率均高于诱导培养1 d时及C组阳性率(P<0.01);A、B组各时间点NGF阳性率均显著高于C组(P<0.01)。ELISA法� 张明 赵红斌 荔志云 杨银书 文益民 董菊子 张全伟 葛宝丰关键词:BMSCS 红景天苷 红景天苷诱导间充质干细胞向多巴胺神经分化 被引量:4 2012年 目的探讨红景天苷(SD)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向多巴胺能神经细胞分化的影响。方法实验分为红景天苷组,维甲酸(RA)组和空白对照组,SD和RA分别诱导BMSCs 1d、3 d、6 d和9 d,细胞免疫荧光化学法检测神经细胞相关标志分子神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经微管相关蛋白2(MAP2)、抗微管蛋白(β-TubulinⅢ)和神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)以及与多巴胺能神经元相关的关键酶多巴脱羧酶(DBH)和多巴胺-β-羟化酶(DDC)的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测诱导前后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质纤维酸性蛋白、核受体相关因子1(Nurr1)、神经营养因子-3(NT-3)和酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的表达;酶联免疫吸附法评价诱导前后细胞表达NT-3、脑源性神经营养因子(BDNF)的水平。结果 SD和RA分别诱导BMSCs 6 d和9 d时细胞增殖明显增强,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),诱导3 d后NSE、MAP2和β-TublinⅢ表达阳性,红景天苷组GFAP表达阳性,维甲酸组GFAP表达阳性。6 d时NSE表达丰度上调;1 d、3 d和6 d诱导组Nurr1 mRNA表达丰度上调,红景天苷组NT-3 mRNA表达水平与维甲酸组比较明显上调,SD组6 d时TH mRNA表达上调。诱导组DBH和DDC阳性率与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。诱导组NT-3和BDNF细胞因子含量增加与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论红景天苷能诱导BMSCs分化为具有多巴胺功能的神经细胞。 张明 荔志云 赵红斌 周杰 武弋 季玮关键词:红景天苷 大鼠骨髓间充质干细胞 多巴胺能神经元 红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的机制研究 被引量:17 2013年 探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)和PI3K/AKT/mTOR信号通路介导红景天苷诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经细胞定向分化中的作用。以小鼠BMSCs细胞系(D1细胞)为研究对象,实验分为对照组和红景天苷诱导组。红景天苷(5、25、50、100和200μg.mL 1)作用于细胞24 h和红景天苷(100μg.mL 1)作用细胞0.5、1、3、6、9、12、24、48和72 h。采用细胞免疫荧光染色方法、实时定量PCR(real-time PCR)和Western blotting技术分别检测细胞NSE、MAP2、β-Tubulin III、NES和GFAP的阳性率和β-Tubulin III、NSE、ERK1/2和AKT的表达;PD98059和LY294002分别阻断ERK1/2和PI3K/AKT/mTOR信号通路后,检测ERK1/2和NSE的表达。结果表明,随着红景天苷诱导时间的延长,NSE、MAP2、NES、β-Tubulin III和GFAP的阳性率明显增加,NSE和β-Tubulin III蛋白的表达显著上调(P<0.01)。随着红景天苷水平和作用时间的增加,ERK1/2、AKT mRNA和蛋白的表达明显上调;PD98059和LY294002分别阻断EKR1/2和PI3K/AKT/mTOR信号通路后,显著抑制红景天苷促进NSE、NES和β-TubulinIII mRNA和NSE蛋白表达。结果提示,红景天苷通过激活ERK1/2和PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进BMSCs向神经细胞定向分化。 陈亚男 刘辉 赵红斌 刘阳 白洁 朱晓娟 王玉关键词:红景天苷 骨髓间充质干细胞 信号通路