国家高技术研究发展计划(2002AA206311)
- 作品数：11 被引量：34H指数：4
- 相关作者：安晓荣陈永福侯健杨兴元关宏更多>>
- 相关机构：中国农业大学中国农业科学院生物技术研究所中国生物技术发展中心更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 胞浆内精子注射技术生产小鼠被引量：11
- 2005年
- 以piezo操作系统为技术支撑 ,在掌握小鼠卵母细胞胞浆内精子注射技术 (ICSI)的基础上 ,进行了ICSI技术生产试管小鼠的尝试。来自成年昆明 (KM)小鼠附睾尾的新鲜精子 ,剪切去尾后 ,直接将精子头注射到B6D2F1小鼠卵母细胞质中 ,注射后 1h ,83 .3%的卵母细胞存活。6h时 ,84 . 0 %的成活卵子成功受精 ,形成原核 ,排出PB2 体外培养的ICSI胚胎 ,卵裂率 (98%vs 94 . 7% )和 4_细胞期胚胎比率 (89 5 %vs 92 . 1% )均与培养的体内受精卵没有差异 (P >0 . 0 5 ) ;但是 ,桑椹胚(6 3 8%vs84 . 2 % )和囊胚发育率 (2 5 .7%vs 6 8. 4 % )极显著地 (P <0 . 0 1)低于对照组。12 0枚原核期胚胎移植给 7只假孕受体后 ,4只受孕小鼠共产出 2 8只ICSI小鼠 (2 3. 3% )。健康成年的 2 5只ICSI小鼠都没有明显的生理和行为异常。随机选择其中的 2 0只小鼠 ,分别进行ICSI小鼠间、ICSI与KM小鼠间共 12组的交配 ,结果所有雌鼠妊娠产仔。在成功建立小鼠ICSI技术的基础上 ,成功获得了我国的首例ICSI小鼠 ,并且证明这些ICSI小鼠都具有正常的繁殖后代的能力。
- 严阿勇李明安晓荣侯健关宏陈永福苟克勉
- 关键词：ICSI囊胚小鼠生殖力
- 高效率基因打靶载体的构建及受体成肌细胞的制备
- 2009年
- 通过建立高效率"双无"(无启动子、无polyA)打靶载体MSTN-GFP和MSTN-neo及新生绵羊和胎儿成肌细胞的培养和鉴定,优化了培养条件,改善了细胞状态,为提高打靶效率及体细胞克隆提供了稳定的核移植供体;同时无启动子打靶载体的构建也有利于打靶后阳性细胞克隆的分子鉴定.
- 张蕾杨兴元安晓荣陈永福
- 关键词：成肌细胞基因打靶
- 牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究被引量：3
- 2010年
- 建立可用于基因打靶的乳腺上皮细胞系是乳腺生物反应器研制的重要环节,分别采用胰蛋白酶、胶原酶及其两者的混合消化液分离获得了包括少量成纤维细胞在内的原代牛乳腺上皮细胞,比较了不同消化方法的优缺点。利用Trypsin-EDTA阶段消化法在体外培养牛乳腺上皮细胞,观察了此细胞培养到第5代、10代、15代和20代时的细胞形态特征和生长特性,比较了该细胞在胶原基质和混合型基质包被培养皿中的培养效果。以乳腺腺泡上皮细胞中的细胞特征蛋白角蛋白18为标志,利用角蛋白18单克隆抗体进行了细胞免疫组化鉴定,证明分离培养细胞的上皮特性。
- 李瑞国苗朝华安晓荣陈永福
- 关键词：体外培养
- myostatin基因打靶的成肌细胞制备被引量：4
- 2009年
- Myostatin(MSTN),β-转化生长因子超家族的一员,是肌肉生长的负调控因子,该基因自然突变的比利时蓝牛和皮尔蒙特牛出现双肌性状。基因敲除该基因,是实现家畜产肉量的提高的有效方法。通过建立无启动子打靶载体MSTN-GFP,MSTN-neo,转染新生和胎儿绵羊骨骼肌细胞,经过表达绿色荧光蛋白报告基因和G418筛选获得骨骼肌细胞克隆,PCR,Southern blot,DNA序列检测获得阳性细胞克隆,为制备myostatin基因敲除的体细胞克隆绵羊提供核移植供体。
- 张蕾杨兴元安晓荣陈永福
- 关键词：基因打靶MYOSTATIN成肌细胞
- 绵羊Myostatin基因启动子的功能分析被引量：6
- 2007年
- 相比于Myostatin基因的作用机制而言，对Myostatin基因转录和表达的调控机制了解很少．为了更好地了解Myostatin基因5’调控区的结构和功能，深入研究Myostatin基因的转录调控机制，在最近的研究中克隆了绵羊Myostatin基因的启动子（Pro）序列（GenBank登录号为AY918121）．进一步以EGFP为报告基因，构建了各种长度的野生型MSTNProw—EGFP载体和E—box元件突变型MSTNPro^TM—EGFP载体，通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系或绵羊成纤维细胞后，对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行荧光定量分析而比较不同条件下绵羊Myostatin基因启动子的转录调控活性．结果表明，0．3～1．2kb的绵羊Myostatin基因启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达，其中1．2kb片段的转录调控活性最高．然而，将绵羊1．2kbMSTNProw-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达，说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性．对稳定转染绵羊1．2kbMSTNProw—EGFP载体的C2C12细胞进行荧光分析，结果表明细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin基因的转录和表达．在C2C12分化状态下，1．2kb野生型绵羊Myostatin基因启动子的活性比成肌状态时显著升高，而1．2kbE（3＋5＋7）突变型Myostatin基因启动子的活性在C2C12分化前后并未表现出差别．这一结果暗示肌肉调控因子MyoD可能是通过与E—box结合而引起Myostatin基因在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的一个原因．
- 杜荣安晓荣陈永福秦健
- 关键词：MYOSTATIN基因启动子C2C12
- 牛胚系基因中两种JH和Cμ抗体基因的克隆与分析被引量：1
- 2005年
- 根据NCBIGenBankTM中登录的2个牛抗体重链可变区J基因(JH)(序列号为AY158087,AY149283)的序列不同之处设计PCR引物,能从同一个体的Holstein牛基因组DNA中扩增得到与以上2个基因分别相同的序列,证明这2个JH基因的差异不是由于牛个体或品种不同引起的.提取牛脾脏总RNA,RT-PCR扩增IgMcDNA,测序结果显示:序列号为AY149283的JH基因中第六外显子JH6是一个功能基因,它可以编码牛IgM的部分CDR3区和完整的FR4区,从2种IgMcDNA克隆的测序结果可以看出,其恒定区序列分别与序列号为U63637和AY230207的2种抗体重链恒定区μ基因(Cμ)cDNA序列相同.PCR扩增JH-Cμ序列,测序结果表明:序列号为AY158087的JH基因是同以上2种Cμ基因分别串连在一起的(序列号分别为AY230207和U63637).以上结果证明:序列号为U63637和AY230207的2个Cμ基因分别与AY149283的JH基因串联在一起,都能够参与牛IgM的产生,它们与AY158087的JH基因共同存在于同一个体Holstein牛胚系基因中.
- 李敏陈丽梅林爱星杨兴元安晓荣陈永福
- 关键词：抗体
- 端粒酶催化亚基基因在小鼠胚胎发育早期的转录活性
- 2005年
- 用RT-PCR引物分别扩增成年昆明(KM) 小鼠睾丸、脾脏、肾脏、肝脏和胸腺组织的总RNA发现,端粒酶催化亚基基因tert在这些组织中都有转录,目标产物正确组装到PMD 18-T载体后测序,结果与已知cDNA序列一致. PMSG/hCG超数排卵方法获得KM小鼠成熟卵母细胞和CZB溶液体外培养的胚胎(KM ♀×KM♂),用酸性Tyrode蒺s溶液消化透明带后,采用巢式RT-PCR,同时分析tert基因和持家基因hprt的转录发现,对于单个样品来说, 全部卵母细胞(15 h-post hCG,10/10) 都存在hprt转录本,其中,只有40%(4/10) 还同时存在tert转录本. 原核形成初期(20 h-post hCG,6/6) 和原核晚期(30 h post-hCG,8/8) 的受精卵,以及发育至2-C早期的胚胎(35 h-post hCG,7/7) 都不转录tert基因,只有hprtmRNA存在;2-C晚期(50 h-post hCG)时,两个基因同时转录(4/8)和一个基因单独转录(4/8)的胚胎各占50%;从4-C阶段(65 h-post hCG,4/4)开始,包括8-C阶段(75 h-post hCG,4/4),桑椹胚阶段(93 h-post hCG,4/4),直至囊胚阶段(118 h-post hCG,4/4),所有的胚胎都同时转录tert和hprt基因,而且转录水平明显升高. 以20枚胚胎量为模板进行RT-PCR发现,原核早期,原核晚期的胚胎中仍然没有tert基因转录,只有hprtmRNA,但是,在2-C早期胚胎中同时检测到了hprt和tert两种mRNA. ?
- 王宇姚慧安晓荣陈永福苟克勉
- 关键词：胚胎HPRT基因端粒酶
- 牛体外受精胚胎的基因组甲基化模式被引量：3
- 2006年
- 利用抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)抗体免疫荧光法检测了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)的牛合子及早期胚胎的基因组甲基化模式.实验结果表明:有61.5%的合子发生了雄原核去甲基化,而34.6%的合子没有发生去甲基化;当胚胎发育到8-细胞时,甲基化水平明显下降,且一直到桑椹胚期仍维持低甲基化状态,但同一枚胚胎的不同卵裂球之间甲基化水平不同;在囊胚期,内细胞团细胞的甲基化水平很低,而滋养层细胞的甲基化水平却很高.本研究结果至少部分地提示,IVM/IVF/IVC可能对牛合子及早期胚胎的甲基化模式有一定影响.
- 侯健刘蕾雷霆华崔秀宏安晓荣陈永福
- 关键词：甲基化胚胎体外受精
- 成年体细胞克隆的绵羊
- 分别以体外培养并且用0.5%FBS饲养的美利奴成年母羊的颗粒细胞和Dorset成年绵羊的耳朵细胞为供体,与体外成熟的去核卵母细胞融合后,Ionomycin/6-DMAP激活的重构胚胎用SOF溶液培养7天后.结果颗粒细胞组...
- 苟克勉安晓荣关宏侯健陈永福
- 关键词：体细胞核移植玻璃化胚胎移植
- 文献传递
- 牛β-酪蛋白座位无启动子基因打靶载体的构建被引量：2
- 2010年
- 将带有新霉素基因(neo)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的质粒pEGFP-C1进行了改造,去掉neo基因的启动子(Psv40),在无启动子的neo和完整的GFP基因两侧分别加入一个LoxP位点。然后将带有LoxP位点、筛选标记基因和报告基因的结构装入左右分别为牛β-casein基因1590bp和5833bp的同源臂结构中,构建成无启动子基因打靶载体pT-1590-LoxP-GFP-LoxP-5833。
- 李瑞国苗朝华侯健关宏安晓荣陈永福
- 关键词：LOXP打靶载体
