国家自然科学基金(31160193)
- 作品数：22 被引量：34H指数：3
- 相关作者：曾韦锟井申荣洪愉黄芬冯梦蝶更多>>
- 相关机构：昆明理工大学成都军区昆明总医院昆明学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金云南省应用基础研究计划面上项目云南省教育厅科学研究基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 随机转座子插入构建甲型副伤寒杆菌启动子文库被引量：1
- 2016年
- 目的构建携带氯霉素乙酰转移酶(CAT)的转座子自杀性质粒,通过接合转座获得甲型副伤寒沙门氏菌(副甲)启动子文库。方法 PCR扩增CAT的基因亚克隆至pMD-18T载体,鉴定正确后酶切插入转座子自杀性质粒pSC189,获得新的转座子载体pSC-CAT,将携带pSC-CAT的供体菌与副甲受体菌进行接合转座,涂布氯霉素平板筛选转座的细菌,以随机筛选出来的细菌基因组为模板,热不对称PCR扩增插入位点侧翼序列,并进行测序、比对分析。结果筛选获得约1000个突变菌,随机挑取6个菌,转座子插入位点的上游分别对应6个可疑启动子区域。结论通过自杀性转座子载体pSC-CAT可高效获得副甲菌启动子文库,为进一步研究副甲菌基因表达与调控奠定了基础。
- 许泽仰洪愉冯梦蝶毛普加赵继华杨洪文宋武战王纪爱黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：甲型副伤寒沙门氏菌
- 带锚定基序3LysM的EGFP融合蛋白与乳酸乳球菌的体外混合展示被引量：4
- 2014年
- 目的探索融合有锚定序列的EGFP蛋白,能否通过体外混合展示于乳酸乳球菌MG1363表面。方法采用融合PCR方法扩增带有锚定序列的egfp(3LysM-egfp),亚克隆至pMD18T载体,测序正确后,插入表达载体pET28a转化BL21(DE3)进行诱导表达、纯化,将纯化的3LysM-EGFP与乳酸乳球菌进行体外混合作用,荧光显微镜及Western-blot检测展示效果。结果成功构建表达重组菌pET28a-3LysM-egfp/BL21并诱导出可溶性3LysM-EGFP,纯化后蛋白纯度达到81.5%,荧光显微镜及Western-blot均检测到展示的目的蛋白。结论纯化后的3LysM-EGFP能在体外条件下展示在乳酸乳球菌表面。
- 冯金洪愉毛普加冯梦蝶许泽仰黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：乳酸乳球菌纯化
- CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定被引量：3
- 2014年
- 以CAT（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）为报告基因,构建p CAT2启动子探针载体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3AⅠ酶切铜绿假单胞菌的基因组,回收（500-1 500 bp）片段并与p CAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库,PCR鉴定文库的多样性,利用氯霉素（10μg/m L）和卡那霉素（50μg/m L）双抗平板筛选了16株阳性菌株,并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容量可达50 000个,覆盖基因全长的3.5倍,插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子,同源性达99%以上,并对其活性进行初步鉴定,为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。
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- 关键词：报告基因
- LSPA1早期基因gp22细菌双杂交诱饵载体与筛选文库的建立
- 2015年
- 构建细菌双杂交系统中的诱饵载体p KT25-gp22和甲型副伤寒沙门氏菌基因文库以便后续的筛选实验。PCR扩增获得gp22基因,插入p KT25构成诱饵质粒p KT25-gp22。提取甲型副伤寒沙门氏菌基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到p UT18C质粒的Bam HⅠ位点,获得基因组DNA表达文库。用化转的方法将诱饵质粒与p UT18C共转入BTH101,检测诱饵质粒自激活作用,并检测诱饵蛋白对宿主菌的毒性。将文库质粒电转至JM109感受态,PCR鉴定文库的多样性。诱饵载体p KT25-gp22无自激活报告基因的能力且对细菌的生长无毒性。所构建的副甲基因组文库覆盖基因组达8倍,满足文库筛选需要。成功构建细菌双杂交系统中诱饵载体p KT25-gp22,筛选文库质量良好,可应用于细菌双杂交实验。
- 冯梦蝶毛普加洪愉许泽仰赵继华杨洪文宋武战黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：诱饵载体基因组文库早期基因甲型副伤寒沙门氏菌
- 与甲型副伤寒杆菌噬菌体LSPA1早期蛋白GP23相互作用的宿主蛋白的筛选
- 2015年
- 目的筛选与甲型副伤寒杆菌（副甲）CMCC50973噬菌体LSPA1早期蛋白GP23相互作用的宿主蛋白。方法 Sau3AⅠ酶切副甲基因组,回收250-1 500 bp的条带与p AT质粒连接,构建p AT-副甲基因文库;扩增噬菌体早期基因gp23,与p BT构建p BT-gp23作为诱饵质粒;将p AT-副甲基因文库和p BT-gp23共转KS宿主菌,利用细菌双杂交技术筛选蓝色单菌。检测筛选出阳性单菌的Lac Z活性,并提质粒测序,分析其编码蛋白。结果成功构建副甲基因文库,其库容量满足实验的要求,基因文库阳性率接近100%;筛选出的插入基因为编码嘌呤透性酶。结论宿主蛋白（嘌呤透性酶）可能与副甲噬菌体LSPA1早期蛋白GP23有相互作用。
- 毛普加冯梦蝶洪愉许泽仰赵继华杨洪文宋武战王纪爱饶贤才黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：甲型副伤寒杆菌噬菌体
- 抗菌药物跨生物膜传递方式的研究进展
- 2016年
- 生物膜是指单一或混合微生物附着于生物或者合成的表面具有一定组织结构的微生物聚集体,其组成成分包括微生物自身及其分泌的多糖基质、纤维蛋白及脂质蛋白。生物膜除了能够帮助细菌耐受多种环境压力,例如紫外线、噬菌体等,更为重要的是它能够阻碍抗生素进入和扩散,是病原菌耐药性形成的重要机制之一。因此,在治疗病原体感染的过程中,选择一种有效的抗菌药物是必要的,但对于形成生物膜的微生物如何将抗菌药物有效地传递至生物膜从而彻底治愈成膜病原菌感染是至关重要的,所以本文就抗菌药物传递至生物膜的运输方式进行综述。
- 冯梦蝶曾韦锟
- 关键词：抗菌药物生物膜
- 甲型副伤寒沙门菌噬菌体的分离及其生物学特性的分析被引量：8
- 2014年
- 目的分离甲型副伤寒沙门菌（副甲菌）噬菌体（副甲噬菌体），并分析其生物学特性。方法从昆明某医院污水中分离副甲噬菌体，并采用噬斑形成法检测其滴度；透射电镜下观察浓缩纯化后的副甲噬菌体形态；分析副甲噬菌体对不同pH（1～12）和不同温度（40、50、60、70、80℃）作用的敏感性；培养副甲菌和副甲噬菌体，以不同培养时间为横坐标，对应的噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，并测定爆发量、最佳MOI及副甲菌突变率；提取副甲噬菌体基因组，酶切分析副甲噬菌体核酸，SDS-PAGE分析副甲噬菌体外壳蛋白；采用热酚法提取脂多糖（1ipopolysac-chafide，LPS），采用苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfnnvl fluoride，PMSF）法提取外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），初步分析副甲噬菌体的受体。结果在医院的污水中分离出的副甲噬菌体，经双层平板计数可见大小不一、透明的噬斑，滴度在109.10mPFU之间，透射电镜观察可见长尾和一个头部；副甲噬菌体在pH值3～10之间滴度较高，40℃以上，随温度上升滴度明显降低，在80℃几乎无活性副甲噬菌体存在；副甲噬菌体感染潜伏期为20min，爆发期为50min，爆发量129，最佳MOI为0.2，副甲菌突变率为5.8×10^-7～2.2×10^-6；副甲噬菌体基因组的单酶切产物均可见33bp的特异条带，SDS-PAGE分析可见4条主带；LPS、OMP能与副甲噬菌体结合，是副甲噬菌体的受体。结论副甲噬菌体为长尾噬菌体，基因组为dsDNA，大小为33bp，最佳MOI为0.2，受体位点为LPS和OMP。
- 毛普加冯金洪愉黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：沙门菌甲型副伤寒细菌噬菌体生物学特性
- 乳酸乳球菌载体疫苗
- 2012年
- 乳酸乳球菌是一种在食品工业中广泛应用的安全级微生物,应用基因工程手段能使乳酸乳球菌表达多种病毒、细菌、寄生虫的外源蛋白。乳酸乳球菌可经粘膜途径免疫,能有效递呈抗原,诱导外源蛋白的特异性免疫应答,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫,因此可作为潜在的疫苗载体。本文对乳酸乳球菌载体疫苗的优势、应用以及疫苗设计时需要考虑的问题进行了概述。
- 刘艳春曾韦锟井申荣
- 关键词：乳酸乳球菌疫苗抗原粘膜免疫疫苗载体
- 乳酸乳球菌表面展示技术被引量：1
- 2013年
- 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是革兰氏阳性益生菌,作为食品安全级微生物,它在当今社会的多个方面得到运用。利用基因工程手段可以将多种外源蛋白质表达并展示在乳酸乳球菌的表面,使蛋白质的生物学功能得以展示,进而应用于工业和农业。又由于乳酸乳球菌不产生脂多糖和其他毒素,所以也能很好地运用于医学等相关研究。
- 冯金曾韦锟井申荣
- 关键词：乳酸乳球菌
- 基于Profinity eXact系统的可溶性egfp表达和纯化被引量：2
- 2014年
- 为研究Profinity eXact系统在蛋白表达及纯化过程中的效果,利用PCR扩增绿色荧光蛋白基因egfp,定向克隆至表达载体pPAL7上,转化BL21(DE3),荧光显微镜下观察诱导后的重组菌;取超声破碎的上清挂柱纯化,紫外下检测纯化后egfp发出荧光的特性,Western blot分析其免疫反应性。结果表明:诱导后的重组菌pPAL7-egfp/BL21(DE3)在紫外光下能够发出绿色荧光;一步纯化后的egfp蛋白同样也能在紫外激发下发出绿色荧光,同时egfp蛋白能和特异性抗体结合,具有良好的免疫反应性。实验结果说明Profinity eXact系统对于可溶性蛋白的表达和纯化,方法操作简单、快捷,具有很好的应用价值。
- 冯金洪愉黄芬井申荣曾韦锟
- 关键词：纯化原核表达
