国家自然科学基金(30471942)
- 作品数：7 被引量：32H指数：3
- 相关作者：宋丽萍邱曙东李跃萍王宁王爱英更多>>
- 相关机构：西安交通大学医学院第一附属医院西安交通大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省科技攻关计划陕西省科学技术研究发展计划项目更多>>
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- NT4p53(N15)Ant融合基因重组腺病毒的构建及其体外抑瘤作用被引量：1
- 2008年
- 背景与目的:有研究发现P53氨基端15肽与穿膜肽(antennapedia,Ant)的融合肽能迅速穿透细胞膜,直接、快速引起乳腺癌、胰腺癌细胞坏死而非凋亡,但对正常细胞几乎没有毒性。本研究构建缺陷型腺病毒载体表达NT4p53(N15)Ant融合基因,研究其体外抑瘤作用。方法:应用Ad-EasyTM系统,在大肠杆菌同源重组,构建NT4p53(N15)Ant腺病毒表达载体,在HEK-293细胞内成功包装并鉴定后,感染肝癌细胞株HepG2,用倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验及培养基中的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)测定研究其体外抑瘤作用。结果:Ad-NT4p53(N15)Ant对肝癌细胞株HepG2有明显抑制作用,48、72、96h细胞存活率分别为36.67%、20.47%、17.82%,与空病毒处理组比较差异有统计学意义(P<0.05);电镜观察到感染的HepG2细胞胞膜、核膜破坏,胞浆内出现囊泡状物质,染色质聚集。Ad-NT4p53(N15)Ant处理HepG2细胞24、48、72、96h时培养液中LDH释放分别为94、236、267、313U/L,较空病毒处理组明显增加,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建的腺病毒载体Ad-NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞后能抑制细胞增殖。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东黄辰王爱英李围围
- 关键词：腺病毒载体肿瘤基因治疗
- 慢病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用被引量：23
- 2006年
- 载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前常用的有病毒载体和非病毒载体两类,病毒载体由于转导效率较高且可以用于体内和体外的基因转导,是目前基因治疗研究和临床应用的主要工具,包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等。慢病毒载体是近来受到广泛注意的一种逆转录病毒载体,由于具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,适于体内基因治疗,因此有望成为理想的基因转移载体。本文以HIV-1为代表对慢病毒载体构建,结构优化及其在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。
- 李跃萍宋丽萍邱曙东
- 关键词：慢病毒载体肿瘤基因治疗
- NT4-p53（N15）-Ant重组慢病毒的构建及其对肝癌细胞的杀伤效应被引量：2
- 2010年
- 目的构建编码融合基因NT4-p53（N15）-Ant的重组慢病毒表达载体，观察其对肝癌细胞的杀伤作用。方法利用PCR体系延伸互为模板的引物，通过T载体克隆法获得p53（N15）．Ant基因克隆，酶切后连入pBV220／NT4质粒，再将融合基因NT4-p53（N15）-Ant亚克隆至慢病毒的表达质粒内，与辅助质粒共同转染HEK-293细胞，通过同源重组，获得融合基因重组慢病毒LV-NT4-p53（N15）-Ant。收集病毒上清，大量扩增并测定其滴度，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测目的基因在HepG2细胞中的表达情况。用LV-NT4-p53（N15）-Ant处理HepG2肝癌细胞，通过光镜、电镜、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色试验、乳酸脱氢酶（LDH）释放法和Annexin V—PI双染实验，研究LV-NT4-p53（N15）-Ant在体外对HepG2细胞生长的影响。结果克隆出p53（N15）-Ant基因，经酶切及测序证实结果正确。得到高滴度（1×10^11pfu／ml）的重组慢病毒表达载体。RT—PCR证实，感染LV．NT4-p53（N15）-Ant的HepG2细胞中有目的基因的表达。在感染后24、48、72h，LV．NT4-p53（N15）．Ant处理组的细胞存活率分别为83．4％、46．9％和33．9％，与LV．EGFP组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。LV．NT4-p53（N15）-Ant处理组细胞在感染48、72、96h后，LDH含量分别为682、815和979 IU／L，与LV.EGFP组比较，差异有统计学意义（P〈0．01），可能与肿瘤细胞膜的破坏有关。结论通过分子克隆体外重组技术，成功制备了NT4-p53（N15）．Ant复制缺陷型重组慢病毒。LV．NT4-p53（N15）-Ant对肝癌细胞具有杀伤能力，为今后的肿瘤基因治疗提供了新的可能性。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东王宁
- 关键词：重组慢病毒肝肿瘤基因治疗
- P53-mdm2相互作用与肿瘤治疗策略被引量：2
- 2005年
- mdm2是P53肿瘤抑制功能的主要调节者,两者之间存在自动调节的负反馈环,mdm2可通过与P53结合促进其降解。由诸多因素造成的mdm2-p53相互关系失衡所带来的直接后果就是导致p53的失活而引起肿瘤的发生。已证明有3种翻译后修饰：磷酸化、寡聚化及与其它蛋白的结合影响着mdm2、P53蛋白复合物的形成。干扰两者的结合,使P53发挥转录活性是抗肿瘤的关键。mdm2和P53蛋白相互作用抑制剂的研究是抗肿瘤治疗的一个新靶点,有广阔的应用前景。
- 宋丽萍邱曙东
- 关键词：P53MDM2肿瘤治疗
- NT4-p53(N15)-Ant融合基因重组腺病毒的构建与鉴定被引量：3
- 2006年
- 目的:构建编码融合基因NT4-p53(N15)-Ant的重组腺病毒表达载体,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法:利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得p53(N15)-Ant基因克隆,酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N15)-Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒PJM17共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒Ad.NT4-p53(N15)-Ant,收集病毒上清,大量扩增并测定其滴度,用RT-PCR检测目的基因在293细胞的表达情况。MTT比色法观察重组病毒对HepG2细胞存活率的影响。结果:克隆出p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(1×1011pfu/ml)重组腺病毒表达载体;反转录聚合酶链反应证实感染Ad.NT4-p53(N15)-Ant的293细胞中有目的基因的表达。Ad.NT4-p53(N15)-Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤作用,与Ad.GFP比较,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒处理组HepG2细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-p53(N15)-Ant复制缺陷型重组腺病毒,为下一步的肿瘤基因治疗奠定了基础。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东杨广笑王全颖
- 关键词：重组腺病毒肿瘤基因治疗
- NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。
- 宋丽萍李跃萍邱曙东杨广笑王全颖
- 关键词：基因克隆肿瘤
- 腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用被引量：3
- 2007年
- 目的构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率。结果克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因。MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小。Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%。结论通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的。
- 李跃萍邱曙东宋丽萍王全颖杨广笑
- 关键词：腺病毒载体HEPG2细胞
