上海市自然科学基金(12ZR1426300)
- 作品数：6 被引量：13H指数：2
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- 人EZH2基因编码区及3'非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达被引量：4
- 2012年
- 目的构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达。方法运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3'UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。Western blot检测mCherry-EZH2的表达。结果测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白。结论成功构建人EZH2基因CDS区及3'UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达。为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3'UTR表达的miRNA奠定前期实验基础。
- 彭攸赵卫卫李晓娇王玉平卢晓佳邬美玉冯景
- 关键词：EZH2基因红色荧光蛋白
- 人乳腺癌上皮细胞miR-217对DNMT1调控作用的研究被引量：1
- 2013年
- 目的验证在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达,为后期动物实验和临床试验提供实验基础。方法利用瞬时转染技术,在对应细胞系中,过表达、抑制miR-217,Western blot检测各实验组中DNMT1蛋白表达,并用含有miR-217野生型及突变型识别位点的DNMT1 3′UTR载体质粒分别转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性改变。结果过表达miR-217,DNMT1表达下降;抑制miR-217,DNMT1表达增高;双荧光素酶检测实验,DNMT1-UTR-WT的相对荧光素酶活性显著低于DNMT1-UTR-MUT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在乳腺癌上皮细胞系中,miR-217对DNMT1表达具有调控作用,且miR-217通过直接作用于DNMT1 3′UTR调控DNMT1表达。
- 王璐璐刘萃萃郭腾陶然彭攸赵卫卫王玉平孙振亮冯景
- 关键词：DNMT1MCF-7MDA-MB-231
- EZH2基因3'非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选被引量：1
- 2013年
- 目的构建携带人EZH2基因3'非翻译区(3'UTR)的慢病毒筛选载体并实现该重组体在人乳腺癌MCF-7中稳定整合,为下一步MicroRNAs(miRNAs)筛选奠定基础。方法从组织中提取并用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出EZH2基因3'UTR,构建携带EZH2基因3'UTR的重组慢病毒载体CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR,脂质体法将重组的慢病毒载体和包装载体混合物共转染工具细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒。用裂解液裂解病毒颗粒,根据慢病毒载体上的CMV启动子表达量检测病毒滴度。用慢病毒颗粒感染乳腺癌MCF-7细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定整合的乳腺癌细胞MCF-7,用Real-Time PCR和Western blotting方法检测EZH2基因3'UTR是否整合入细胞MCF-7中。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序结果证实,EZH2基因3'UTR成功定向克隆到慢病毒载体上。Real-Time PCR检测病毒滴度为4.3×109拷贝/mL。筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL。重组慢病毒转导MCF-7后,Real-Time PCR和Western blotting方法分别检测EZH2基因3'UTR整合到乳腺癌细胞MCF-7基因组中。慢病毒感染实验组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建携带EZH2基因3'UTR慢病毒筛选载体,实现重组体在乳腺癌MCF-7细胞中稳定整合。
- 赵卫卫彭攸李晓娇卢晓佳王玉平刘萃萃王璐璐冯景
- 关键词：EZH2非翻译区慢病毒载体MCF-7
- EZH2及DNMT1在三阴性乳腺癌中的表达及意义被引量：7
- 2015年
- 目的探讨EZH2及DNMT1在三阴性乳腺癌中的表达特点及与主要临床病理参数的关系。方法采用免疫组化SP法,检测131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌及65例癌旁组织中EZH2及DNMT1的表达情况。采用多因素logistic回归分析EZH2及DNMT1阳性表达有关的因素,Spearman等级相关分析三阴性乳腺癌中EZH2及DNMT1表达的相关关系。结果 EZH2蛋白在三阴性乳腺癌组织、非三阴性乳腺癌组织和癌旁组织的阳性表达率分别为86.3%、89.7%和40.0%;DNMT1蛋白在三种组织中的阳性表达率分别为63.4%、66.6%和44.6%;两种蛋白在乳腺癌组织中的表达均高于癌旁组织(P<0.05);两种蛋白在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织间表达差异无统计学意义。在三阴性乳腺癌中,EZH2阳性表达与肿瘤组织学分级、肿瘤直径、淋巴结是否转移有关(P<0.05),DNMT1的表达与肿瘤组织学分级、淋巴结是否转移有关(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,肿瘤组织学分级为影响EZH2及DNMT1表达的最主要因素;三阴性乳腺癌中DNMT1与EZH2的表达呈正相关(r=0.34,P<0.01)。结论 EZH2与DNMT1的高表达与三阴性乳腺癌的分化、生长、转移有关,且两者在三阴性乳腺癌中的表达呈正相关,其联合检测可能对三阴性乳腺癌的预后判断更有价值。
- 武萍萍陶然彭攸赵卫卫刘萃萃王璐璐胡朝晖王玉平孙振亮冯景
- 关键词：DNA甲基转移酶1
- 谷氨酰胺诱导nestin阳性大鼠骨髓间充质干细胞分化为施万细胞样细胞
- 2015年
- 组织工程技术的发展为外周神经损伤提供了新的治疗方法[1], 尤其在较长的外周神经缺损中可以解决自体神经移植供源不足的问题。近些年研究表明, 施万（Schwann） 细胞在外周神经发育和促进外周神经的再生和修复中起着重要的作用[2-3]。施万细胞作为外周神经组织工程中重要的种子细胞之一, 但是自体来源的施万细胞数量和增殖能力有限, 不能满足组织工程化的需要, 因此获得充足的细胞用于移植成了问题的关键。
- 赵剑
- 关键词：骨髓间充质干细胞施万细胞
- 人乳腺癌上皮细胞miR-217对EZH2表达的调控作用
- 2013年
- 目的验证乳腺癌上皮细胞中miR-217是否通过直接作用于homolog2 zeste基因增强子(EZH2)3'UTR调控EZH2表达。方法利用RT-PCR技术检测人正常乳腺上皮细胞系HBL-100及乳腺癌上皮细胞系MCF-7、MDA-MB-231细胞株中的miR-217,在低表达miR-217细胞株中转染miR-217模拟物(miR-217 minics),在高表达miR-217细胞株中转染miR-217抑制剂(miR-217 inhibitor);Western blot法检测各实验细胞中的EZH2蛋白。用含有miR-217野生型及突变型识别位点的EZH2 3'UTR载体(UTREZH2-UTR-WT和EZH2-UTR-MUT)质粒分别转染人胚肾细胞293T,检测其相对荧光素酶活性。结果 miR-217在MDA-MB-231细胞中低表达,转染miR-217 minics后,其EZH2蛋白表达下降;miR-217在HBL-100中高表达,转染miR-217 inhibitor后,其EZH2蛋白表达增高。人胚肾细胞293T中EZH2-UTR-WT的相对荧光素酶活性低于EZH2-UTR-MUT,两者相比,P<0.05。结论在乳腺癌上皮细胞中,miR-217对EZH2的表达具有调控作用,且miR-217通过直接靶向EZH2 3'UTR调控EZH2表达。
- 王璐璐刘萃萃郭腾陶然彭攸赵卫卫王玉平孙振亮冯景
- MiR-217对乳腺癌上皮细胞甲基化关键基因调控作用的研究
- 目的:探讨在人乳腺癌上皮细胞系中,miR-217通过直接作用于DNMT1与EZH2 3UTR调控DNMT1及EZH2转录后表达水平,为后期动物实验和临床试验提供实验基础。方法::首先利用实时定量PCR技术,检测HBL-1...
- 王璐璐冯景
- 关键词：DNMT1基因EZH2基因MCF-7MDA-MB-231
- 文献传递
