中央高校基本科研业务费专项资金(DL10BA06)
- 作品数：7 被引量：10H指数：1
- 相关作者：王春生朴善花安铁洙张志人王子竹更多>>
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- 小鼠miR367逆转录病毒载体的构建与检测被引量：1
- 2013年
- 为了探明小鼠体细胞重编程过程中miR367的作用机制,试验构建小鼠miR367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR367的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR367并将其连接到pMD18-T载体,然后对重组质粒进行双酶切并回收目的片段。将目的片段与pMXs逆转录病毒载体连接,然后依次经过酶切、PCR筛选阳性克隆和测序,最终构建逆转录病毒载体miR367-pMXs;采用磷酸钙法将miR367-pMXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,逆转录后获得cDNA,并采用Q-PCR方法检测侵染细胞中的miR367表达量。结果表明,被逆转录病毒侵染后,小鼠胚胎成纤维细胞中miR367的相对表达量比侵染前约提高了170倍。上述结果表明,成功构建小鼠miR367的逆转录病毒载体,为开展体细胞重编程机制的相关研究提供依据。
- 张志人安铁洙王子竹朴善花王春生
- 关键词：细胞重编程MICRORNA逆转录病毒载体
- 带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测
- 2012年
- 为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞(NIH3 T3细胞)后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX-Sox2-IRES-GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3 T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据。
- 渠俊杰陈霞王春生张志人安铁洙朴善花
- 关键词：小鼠逆转录病毒载体GFP
- 小鼠L-Myc基因逆转录病毒载体的构建与检测
- 随着对诱导多能干细胞(iPS细胞)的深入研究,如何优化诱导条件、诱导效率以及避免其癌变成为了关键。已有研究表明,在培育iPS细胞的时候,使用基因'L—Myc'代替基因'c—Myc',可大幅降低iPS细胞癌变的风险,从而有...
- 王子竹王春生张志人朴善花安铁洙
- 关键词：诱导多能干细胞逆转录病毒
- 文献传递
- 小鼠Lin28基因的克隆及原核表达
- 2011年
- 目的探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法。方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点(NcoⅠ及XhoⅠ)引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上。对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a(+)载体相连接并转化Rosetta(DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析。结果对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA(NM_145833)相比同源性为99.37%,与参照氨基酸序列相比同源性为100%;在IPTG诱导下pET-30a(+)-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质。结论利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础。
- 宁方勇王春生张秋婷安星兰朴善花安铁洙
- 关键词：ICR小鼠克隆原核表达
- 绵羊c-Myc的克隆与序列分析被引量：1
- 2013年
- 参照GenBank上绵羊c-Myc序列设计引物,利用RT-PCR技术从60d左右胎羊生殖嵴总RNA中扩增得到绵羊c-Myc基因编码区序列,其为包括终止密码子在内的1320 bp,编码有439个氨基酸。同源性分析结果显示,绵羊c-Myc基因编码区与牛、猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼的核苷酸序列同源性分别为98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%和63.9%,其氨基酸序列同源性分别为98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%和64.6%;生物信息学软件分析显示,绵羊c-Myc含有细胞核定位模体和HLH结构域。本研究为进一步研究c-Myc基因的功能及探讨其中绵羊体细胞重编程中的作用奠定了基础。
- 王子竹安铁洙李昊朴善花王春生
- 关键词：绵羊
- 绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测被引量：1
- 2012年
- 为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。
- 赵健灵安铁洙张志人王子竹朴善花王春生
- 关键词：绵羊成纤维细胞逆转录病毒载体
- 小鼠microRNA367逆转录病毒载体的构建与检测
- 为进一步研究microRNA在细胞重编程机制中的作用,构建小鼠microRNA367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠microRNA367的相关序列设计引物,在上游引入BamHI,下游引入XhoI,然后以成年ICR小鼠...
- 张志人王春生王子竹朴善花安铁洙
- 关键词：体细胞重编程逆转录病毒载体
- 文献传递
- 小鼠骨骼肌Desmin启动子的克隆及表达活性分析
- 为了探明小鼠Desmin基因启动子在体细胞中的表达活性,本研究根据NCBI中小鼠Desmin启动子的序列,利用生物软件Primer Premier 6.0设计序列上、下游引物,克隆小鼠基因组中Desmin启动子片段,然后...
- 薛超王春生张志人朴善花安铁洙
- 关键词：小鼠启动子活性分析
- 文献传递
- 绵羊Lin28 cDNA的克隆与序列分析
- 参照GenBank上牛、猪、小鼠和人的Lin28 cDNA序列设计简并引物,利用RT-PCR技术从60d胎羊小肠总RNA中扩增得到绵羊Lin28基因编码区序列,其为包括终止密码子在内的630bp,编码有209个氨基酸。同...
- 王春生张志人王子竹张志崇朴善花安铁洙
- 关键词：绵羊
- 文献传递
- microRNA在诱导体细胞重编程中的作用被引量：7
- 2012年
- microRNA是调控基因转录后水平的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。大量研究证实,microRNAs广泛分布于真核生物,其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPS)是将体细胞诱导成为具有胚胎干细胞性质的多潜能干细胞。iPS过程的核心为体细胞表观遗传状态发生重编程,因此,探明体细胞重编程机制对建立完善的iPS技术具有重要理论和实际意义。利用病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等因子导入体细胞的方法已不断发展,但"基因组整合"及原癌基因的参与增加了诱导细胞的致癌率。随着使用腺病毒、质粒或蛋白诱导等"非整合型"方法及L-myc的替换均可获得具有多潜能性的干细胞,癌变的风险大大降低。但其发生的理论机制仍不十分清楚。最近的研究证实,microRNAs影响体细胞的重编程过程,特别是miR302/367、miR200、miR-34和miR290/295等家族的microRNAs在体细胞诱导为iPS过程中发挥重要作用。文章就近年microRNA在诱导多能干细胞中的作用进行综述。
- 王春生张志人朴善花安铁洙
- 关键词：MICRORNA诱导多能干细胞体细胞重编程
