国家自然科学基金(30271172)
- 作品数：25 被引量：68H指数：5
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- 结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因重组穿梭质粒的构建及其在BCG中的融合与分泌表达研究被引量：4
- 2006年
- 通过SOE法(重叠延伸,Genesplicingbyoverlapextension),扩增cfp10-esat6融合基因,与穿梭整合质粒pMV361构建成重组质粒。另将BCGα抗原(α-Ag)信号肽序列与上述重组质粒构建成另一重组质粒。将两种重组质粒分别导入BCG菌构建融合型重组卡介苗和分泌型重组卡介苗,热诱导后分析其表达产物。本研究成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合及分泌表达的重组BCG,为发展新型结核病疫苗打下了一定的基础。
- 王晓樱鲍朗赵明才张会东龙洋
- 关键词：结核分枝杆菌卡介苗
- 人IL-12与结核分枝杆菌抗原ESAT-6联合基因疫苗的免疫效果观察被引量：12
- 2007年
- 人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcIL-12＋pcESAT-6）.B、D、E质粒免疫组小鼠分别于胫前肌肌肉注射布比卡因（7.5g/L）和质粒的混和物（1：4,100μL,含质粒70μg/次）,A组小鼠肌肉注射生理盐水和布比卡因的混和物（1：4,100μL）,均间隔2周免疫一次,共免疫3次;末次免疫时,C组小鼠皮下注射BCG菌液,0.3mL/只,含10^6CFU/mL.末次免疫后14d和28d,各组小鼠分别取血分离血清用于总IgG测定,同时分离脾细胞,经TB-PPD刺激后检测脾细胞增殖（XTT比色法）活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分泌水平.pcESAT-6质粒DNA单独免疫（D组）或与pcIL-12质粒DNA联合免疫（E组）,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且抗体水平在末次加强免疫后14～28d逐渐增加;但pcIL-12与pcESAT-6联合免疫后,特异性抗体水平较pcESAT-6单独免疫增加不明显（P＜0.05）.c、D、E组免疫小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,E组小鼠特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平明显强于C组和D组（P＜0.05）,而IL-4分泌水平相互间未发现明显差异.末次加强免疫后14～28d,E组小鼠脾细胞增殖活性维持在较高水平,而C组小鼠脾细胞增殖活性先低后高,D组则先高后低;IFN-γ诱生水平,E组最高,C组次之,D组最低.pcIL-12与pcESAT-6质粒DNA联合免疫后能刺激机体产生强烈的细胞免疫和稳定的体液免疫,在动物体内诱发的细胞免疫较ESAT-6或BCG单独免疫时均有明显增加并维持较长时间,此外联合免疫后诱导的体液免疫也较BCG免疫有明显增加.
- 郝牧鲍朗高蕾
- 关键词：白细胞介素12结核分枝杆菌ESAT-6
- 结核分枝杆菌突变gyrase A基因原核表达载体的构建与鉴定
- 2006年
- 目的构建结核分枝杆菌Ser95Thr突变DNA促旋酶A(DNA gyrase A)基因原核表达载体并鉴定,为进一步研究奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用重叠延伸剪切技术,分别通过3次PCR扩增Ser95Thr突变gyrase A基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET-32 a(+),获得重组表达质粒pET-mgyr。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ser95Thr突变gyrase A基因,经过酶切、PCR和测序鉴定,表明突变gyrase A基因正确地插入原核表达载体pET-32 a(+)。结论成功构建了原核表达载体pET-mgyr,为Ser95Thr突变gyrase A基因的功能研究奠定了基础。
- 赵明才鲍朗
- 关键词：结核分枝杆菌GYRASEA基因克隆
- 结核分枝杆菌免疫相关蛋白PPE68的表达及免疫原性的研究
- 2005年
- 目的:克隆、表达结核分枝杆菌PPE家族蛋白PPE68的编码基因Rv3873,并初步探索PPE68诱导Balb/c小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,为进一步研究PPE68的免疫功能提供实验依据。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv3873基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET32a(+),获得重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达,纯化表达产物,通过XTT比色法检测重组蛋白PPE68诱导脾淋巴细胞的增殖活性。结果:重组质粒pETRv3873构建成功,57kDa的His-PPE68融合蛋白在大肠杆菌中稳定表达,并具有刺激Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的功能。结论:PPE68蛋白具有较强的免疫原性,其免疫学功能具有进一步研究的价值。
- 王晓琳鲍朗朱庆平龙洋张会东钟琪
- 关键词：PPE68免疫原性结核分枝杆菌
- IL-12基因重组卡介苗免疫效应研究被引量：3
- 2008年
- 目的：本研究在已构建人IL-12基因重组卡介苗（rBCG-12）,并在体外成功诱导表达IL-12的基础上,进一步研究其免疫后在小鼠体内诱导细胞和体液免疫应答的能力,探讨rBCG-12免疫后对小鼠免疫效应的影响。方法：近交系BALB/c小鼠36只,随机分3组：BCG组、rBCG-12组与PBS组。实验小鼠皮下多点注射细菌悬液0.3mL/只,其中活菌量为1×10^6 CFU/mL,免疫一次,PBS组仅注入PBS液。末次免疫后6周、8周、10周、12周分别分离小鼠血清测定特异性抗体水平,同时分离脾细胞,体外培养经BCG-PPD刺激后检测脾细胞增殖（XTT比色法）活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分泌水平。结果：PBS对照组各时间点均未检测到特异性抗体的产生。免疫后8周时rBCG-12组检测到抗体产生,而BCG组在免疫后10周才检测到抗体产生,且10周时与rBCG-12组抗体水平差异无统计学意义,之后两组抗体水平均有明显增高,免疫后12周时抗体滴度分别达到了1/640（rBCG-12）组和1/320（BCG组）（P〈0.05）。BCG组与rBCG-12组间脾细胞增殖反应变化趋势相同,但rBCG-12组增殖反应明显强于BCG组（P〈0.05）。免疫后10周时两组细胞增殖均达到最高峰,之后逐渐下降,rBCG-12组较BCG组下降缓慢,12周时rBCG-12组的增殖反应仍然维持在高水平。免疫后6-8周BCG组和rBCG-12组IFN-γ的产生均呈逐渐上升趋势。BCG组IFN-γ量在免疫后8-10周达到最高峰,12周时IFN-γ量降至100pg/mL。rBCG-12组8周时IFN-γ的量上升到约为200pg/mL,之后仍继续增加,10周时达最高峰,约为350pg/mL,12周时IFN-γ的量约为250pg/mL,明显高于BCG组（P〈0.05）。而各时间点各组IL-4产生水平均不明显,BCG组与rBCG-12间P〉0.05。结论：rBCG-12免疫后能明显改善机体免疫反应向Th1型极化,产生高水平的细胞免疫反应,而其对体液免疫反应有抑制的趋势,有利于机体抵抗结核菌感染。
- 郝牧鲍朗高蕾张会东
- 关键词：白介素12结核分枝杆菌重组卡介苗免疫反应
- 结核杆菌CFP-10／ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究被引量：2
- 2006年
- 目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。
- 李岩鲍朗张会东商正玲钟琪李娅莎
- 关键词：CFP-10ESAT-6融合基因重组耻垢分枝杆菌
- 结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用被引量：1
- 2007年
- 目的 对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法 以PCR扩增Rv0901基因编码序列，定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒，将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌，构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达，用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果 成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌，其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染，重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO（一氧化氮）的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论 Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。
- 钟琪鲍朗吴悦涵李岩王晓樱商正玲张会东
- 关键词：结核分枝杆菌重组耻垢分枝杆菌
- 结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。
- 赵明才鲍朗吴悦涵张会东
- 关键词：结核分枝杆菌穿梭载体
- IL-12基因不同亚基真核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2006年
- 目的:克隆并构建含人白介素12(hIL-12)基因p35、p40不同亚基的真核表达载体,瞬时转染真核细胞并诱导IL-12的表达。方法:人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和人白血病细胞株(HL-60),经DMSO、IFN-γ和LPS诱导后,用RT-PCR及SOEPCR扩增IL-12p40、p35及p40-p35融合基因;并构建pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达载体。以3种重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞后,通过RT-PCR及ELISA法检测目的基因的表达。结果:经诱导后,从HL-60细胞中扩增到IL-12p40和p35基因片段;但从THP-1细胞中只扩增到p35基因片段,未能扩增到p40基因片段;经酶切鉴定、PCR扩增及序列测定表明pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达质粒构建成功;并在COS-7细胞中可检测到IL-12的表达。结论:含hIL-12基因不同亚基的真核表达质粒的成功构建,对进一步研究IL-12在免疫应答中的调节作用以及作为免疫佐剂改善BCG免疫保护效果的研究奠定了基础。
- 郝牧鲍朗张会东高蕾李娅莎
- 关键词：白细胞介素12真核表达瞬时转染
- 结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用被引量：1
- 2006年
- 目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。
- 李岩鲍朗张会东王晓樱朱海龙李娅莎
- 关键词：CFP-10酵母双杂交蛋白间相互作用结核分枝杆菌
