上海市教委科研基金(06BZ020)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：张艳刘伟刘伟金蓉崔磊更多>>
- 相关机构：上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市组织工程研究重点实验室更多>>
- 发文基金：上海市教委科研基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- Cathepsin K基因siRNA的筛选及其质粒载体的构建被引量：2
- 2009年
- 目的筛选出对人Cathepsin K(CTSK)基因抑制效率最高的1对siRNA,并通过质粒载体表达该siRNA,为进一步抑制去分化人软骨细胞中CTSK的表达奠定基础。方法针对Cathepsin K基因设计4个靶位点,并根据靶位点合成4对siRNA,并转染人软骨细胞。通过Real-timePCR检测4对siRNA中抑制效率最高的1对,与线性化的PGCsilencer-Hl/Neo/GFP连接、转化、扩增与纯化质粒。结果4对siRNA转染软骨细胞后72h,通过对照FITC-siRNA的绿色荧光观察,siRNA的转染效率达到70%～80%。Real-time PCR检测每对siRNA的CTSK量与对照组比的百分率得到其抑制效率,分别为:第1对的比值大于对照组(无抑制作用),第2对47.5%,第3对53.1%,第4对67.3%(抑制效率最大)。成功构建出pGCsilencerTMH1/Neo/GFP/CTSK RNAi载体,经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100%正确。结论成功构建了CTSK基因的siRNAs表达质粒,为进一步研究抑制该基因表达对延缓软骨细胞的去分化过程并促进其成软骨能力奠定了基础。
- 张艳金蓉刘伟
- 关键词：基因双链RNA
- Cathepsin K基因抑制后对软骨细胞功能的影响研究被引量：1
- 2009年
- 目的研究应用RNA干扰技术早期抑制人Cathepsin K(CTSK)基因的表达对延缓软骨细胞的去分化过程及维持软骨细胞表型的影响。方法pGCsilencerTMH1/Neo/GFP/CTSK RNAi质粒体外转染人软骨细胞,并用G418筛选3周,再通过RT-PCR检测CTSK、Ⅱ型胶原和Aggrecan cDNA转录的表达,Western-Blot、免疫荧光检测转染后软骨细胞的CTSK、Ⅱ型胶原和Aggrecan在蛋白水平的表达。结果装入质粒载体转染第1代的软骨细胞,在体外通过细胞形态观察可发现,抑制CTSK基因后3周软骨细胞仍大多数保持多角形,而对照组则向成纤维样细胞形态变化。RT-PCR结果显示,在mRNA水平抑制了CTSK的表达,而不影响对软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA表达。免疫荧光和Western-blot的结果证实了在早期抑制了软骨细胞CTSK基因表达并维持3周左右,软骨细胞的特异性基质Ⅱ型胶原和Aggrecan在蛋白水平明显增加。结论早期抑制了软骨细胞CTSK基因的表达,可使软骨细胞去分化过程中其软骨特异性基质Ⅱ型胶原和Aggrecan增加,说明可以维持软骨细胞的表型。
- 柴岗崔磊张艳
- 关键词：组织蛋白酶KRNA干扰软骨细胞去分化
