国家自然科学基金(30801195)
- 作品数：8 被引量：39H指数：3
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- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划重庆市自然科学基金更多>>
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- 原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞自分泌转化生长因子β1浓度检测及对转化生长因子β1增殖的调节被引量：3
- 2011年
- 背景:体外实验常采用外源性转化生长因子β1刺激来观察细胞增殖变化,易忽略细胞本身自分泌转化生长因子β1的影响。目的:检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞(L929)自分泌转化生长因子β1的浓度和细胞增殖的变化。方法:Elisa试剂盒检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞各时相点细胞内和培养上清中生长转化因子β1水平。结果与结论:纤维肉瘤细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而升高,原代成纤维细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而降低;两种细胞培养上清转化生长因子β1浓度均随时间而上升,但纤维肉瘤细胞显著高于原代成纤维细胞(P<0.01),峰值时达到原代成纤维细胞的20倍;两种细胞增殖曲线在72h内均随时间而显著增高(P<0.01),同一时间点比较,纤维肉瘤细胞明显高于原代成纤维细胞。提示自分泌转化生长因子β1具有促进细胞增殖的作用,不同的自分泌水平可能是影响原代成纤维细胞这种正常细胞和纤维肉瘤细胞肿瘤细胞对于外源转化生长因子β1反应不同的重要原因。
- 刘苹李平彭艳杨楠周元国
- 关键词：转化生长因子Β1细胞增殖纤维肉瘤细胞自分泌
- 大、小剂量TGF-β1刺激大鼠皮肤成纤维细胞24h后检测c-Ski和Smad3的表达及其生物学意义
- 2009年
- 目的:探讨大、小剂量转化生长因子β1(TGF-β1)刺激大鼠皮肤成纤维细胞24h后检测c-Ski和Smad3的表达及其生物学意义.方法:大、小剂量TGF-β1刺激体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞,24h后采用WesternBlot和荧光实时定量PCR观察c-Ski,Smad3,CyclinD蛋白和c-Ski,Smad3mR-NA水平的变化情况;pcDNA3.0-LacZ报告基因免疫组化染色来确定转染效率,BrdUELISA法检测c-Ski和Smad3质粒分别转染或转染同时加大、小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖的变化.结果:不同剂量TGF-β1刺激24h后,小剂量刺激可显著提高c-Ski,CyclinD的表达水平,而Smad3表达水平无显著变化;大剂量刺激可显著提高Smad3的表达水平和显著降低CyclinD的表达水平,c-Ski表达水平无显著变化.转染c-Ski可以促进细胞增殖,但同时降低了大、小剂量TGF-β1调节细胞双向增殖的幅度;转染Smad3可以抑制细胞增殖同时也降低了大、小剂量TGF-β1调节细胞双向增殖的幅度.结论:大、小剂量TGF-β1刺激24h后引起Smad3和c-Ski表达不同变化决定了细胞的增殖状态,这也是大、小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖作用的可能机制之一.
- 李平熊仁平刘苹赵艳陈星云周元国
- 关键词：SMAD3成纤维细胞
- Smad3基因siRNA对TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖的影响被引量：3
- 2010年
- 目的构建大鼠Smad3基因特异性siRNA沉默质粒,并探讨其在TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖中的作用。方法构建大鼠Smad3基因沉默质粒,荧光纤维镜观察转染效率,定量PCR、免疫组化法检测Smad3基因和蛋白的变化,BrdU ELISA法和EMSA法分别检测转染siRNA及联合大小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖和Smad3结合活性变化。结果沉默质粒转染效率为41.2%,瞬时转染后具有促增殖作用且与转染剂量成正比,并使其mRNA表达下调50%、蛋白表达明显降低,还可降低大小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖和Smad3结合活性的变化程度。结论pSUPERSmad3沉默质粒构建成功,TGF-β1可通过调节Smad3来达到双向调节成纤维细胞增殖作用。
- 李平刘苹陈星云赵艳宁亚蕾杨楠周元国
- 关键词：SMAD3基因RNA干扰TGF-Β1成纤维细胞细胞增殖
- c-Ski在TGF-β1调节成纤维细胞和纤维瘤细胞增殖差异中的作用研究
- 目的:探讨c-Ski在TGF-β1调节成纤维细胞和纤维瘤细胞增殖差异中的作用及机制。方法:应用不同剂量TGF-β1及联合转染c-Ski RNAi等途径,作用于原代小鼠成纤维细胞和纤维瘤细胞系,采用MTT法、BrdU掺入法...
- 刘苹李平熊仁平陈星云赵艳周元国
- 关键词：TGF-Β1成纤维细胞细胞增殖
- 文献传递
- 基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制被引量：4
- 2013年
- 目的建立基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定。方法采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA。纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量。结果经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA。获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5%;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9%(P<0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg。结论建立了基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础。
- 彭艳李平刘苹周元国
- 关键词：重组质粒基因治疗层析
- Wistar大鼠c-ski基因部分序列的克隆、测序及实时荧光定量PCR的建立被引量：3
- 2009年
- 目的测定Wistar大鼠c-ski基因部分序列,并应用于检测大鼠c-ski基因表达的实时荧光定量PCR的建立。方法提取培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞总RNA,通过RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到PMD-18T载体上并测序。根据获得的c-ski基因部分序列设计实时荧光定量PCR引物,建立SYBRgreen定量PCR检测方法,并检测培养的大鼠皮肤成纤维细胞c-skimRNA表达水平。结果获得的Wistar大鼠c-ski基因cDNA序列长561bp,为未曾报道的新序列,其与人、小鼠具有较高的同源性,Gen-Bank收录(收入号DQ409171)。建立的SYBRgreen定量PCR检测标准品在103～109拷贝范围内的相关系数为0.99149。体外培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞样品中c-skimRNA水平为(1.02±0.18)×106拷贝/μl。结论新获得了Wistar大鼠c-ski基因部分序列,该序列可用于实时荧光定量PCR的建立。
- 李平刘苹熊仁平赵艳朱敏周元国
- 关键词：克隆聚合酶链反应
- 大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察
- 2010年
- 目的构建大鼠c-ski基因的特异性siRNA沉默质粒,并评价其在大鼠皮肤原代成纤维中的干扰效果。方法采用pSUPER质粒构建大鼠c-ski基因siRNA的重组真核表达质粒,转染大鼠皮肤成纤维细胞,采用荧光纤维镜观察转染效率,BrdUELISA法检测转染后细胞增殖情况并作为其干扰效果的初步筛选,定量PCR、免疫组化法检测c-ski基因和蛋白的表达变化。结果构建3个c-SkisiRNA沉默质粒,按照质粒(μg)/脂质体(μl)1∶2.5的比例转染时效率最高,约为53.5%。转染c-SkisiRNA沉默质粒后,细胞增殖降低,且抑制效果与转染剂量成正比。定量PCR、免疫组化法结果显示转染后c-ski基因表达下调51%(P<0.01),蛋白表达明显降低。结论c-Ski沉默质粒构建成功,瞬时转染大鼠皮肤原代成纤维细胞后可以显著抑制c-ski基因和蛋白的表达。
- 李平刘苹陈星云赵艳彭艳陈磊周元国
- 关键词：RNA干扰转染
- c-Ski在TGF-β1双向调节小鼠皮肤原代成纤维细胞增殖中的作用
- 目的:探讨c-Ski在TGF-β1双向调节小鼠原代成纤维细胞增殖中的作用。方法:培养原代Balb/c小鼠皮肤原代成纤维细胞,采用MTT法检测不同剂量TGF-β1(2.5pg/ml,25pg/ml,250pg/ml,2.5...
- 彭艳李平陈磊刘苹周元国
- 关键词：TGF-Β1SMAD3成纤维细胞
- 文献传递
- 大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察
- 目的:构建大鼠c-ski基因的特异性siRNA沉默质粒,并评价其在大鼠皮肤原代成纤维中的干扰效果。方法:采用pSUPER质粒构建大鼠c-ski基因siRNA的重组真核表达质粒,转染大鼠皮肤成纤维细胞,荧光纤维镜观察转染效...
- 李平刘苹陈星云赵艳彭艳陈磊周元国
- 关键词：RNA干扰转染细胞增殖
- 文献传递
- TGF-β1受体1和2在TGF-β1调节细胞增殖中的作用被引量：25
- 2017年
- 转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种多功能细胞因子,在细胞增殖、分化、伤口愈合和肿瘤生成转移等过程中均发挥重要调控作用。TGF-β1对细胞增殖的调节可因细胞类型、刺激剂量不同而不同,但其差异调节的机制还不清楚。现普遍认为,TGF-β1在TGFBR2/TGFBR1二聚体参与下通过经典的Smad信号通路抑制增殖,而通过非Smad信号通路促进细胞周期,但是机体是如何调控这种不同增殖调节作用转化的还不明确。TGFBR1和TGFBR2在细胞中的分布和比例变化可能是TGF-β1差异性调控细胞增殖作用的一个重要机制。
- 王秋实李平
- 关键词：细胞增殖
